یِاهو مارکت

فروشگاه یاهو

یِاهو مارکت

فروشگاه یاهو

آمار : 236957 بازدید Powered by Blogsky

مقایسه و ارزیابی کارآیی انتقال و بیان ژن GFP به سلول‌های یوکاریوتی توسط سازه‌های فاژی لامبدا و M13

چکیده:

ژن‌درمانی به عنوان روشی نوین برای درمان برخی بیماری‌های ژنتیک و سرطان، جایگاه ویژه‌ای را در عرصه پزشکی به خود اختصاص داده است. با این وجود موفقیت این روش درمانی الزامات گسترده‌ای دارد که ازآن جمله می‌توان به انتقال مؤثر ترانسژن، القاء بیان و کنترل میزان بیان در سلول هدف اشاره کرد. در میان گستره وسیعی از انواع ناقل‌های ژنی ویروسی و غیرویروسی، باکتریوفاژها به علت ویژگی‌های منحصر به فردی که دارند به عنوان حامل‌های ژنی بی‌خطر برای استفاده در بالین معرفی شده‌اند. دانشمندان تا کنون انواع متعددی از تحویل‌دهنده‌های ژنی مبتنی بر فاژ را طراحی نموده‌اند. در این میان دو فاژλ و M13 کارآیی به نسبت خوبی را در انتقال ژن از خود نشان داده‌اند. آنچه که در رابطه با این دو ناقل فاژی حائز اهیمت می‌باشد این است که سازه‌های فاژی مبتنی بر فاژهای λ و M13 به دلیل ساختار ژنومی متفاوتی که دارند انتظار می‌رود که کارآیی متفاوتی نیز در انتقال و بیان ترانسژن از خود نشان دهند. در این مطالعه ناقل‌های ژنیλ-ZAP-CMV و pCMV Script حاوی ژن GFP به ترتیب به عنوان سازه‌های ژنی مبتنی بر فاژهای λ و M13 مورد استفاده قرار گرفتند. ابتدا ذرات فاژی -GFPλ تکثیر شده و سپس از ذرات فاژی مذکور با روش برش و خارج‌سازی درون سلولی (In Vivo Excision) با کاربرد فاژ کمکی R408 ذرات فاژی M13-GFP تهیه شدند. ذرات فاژی حاصل پس از تأیید و تکثیر برای آلوده‌سازی سلول‌های AGS مورد استفاده قرار گرفتند و جهت تأیید ورود ذرات فاژی، سلول‌های تیمار شده توسط میکروسکوپ فلورسانس و نیز واکنش PCR مورد بررسی قرار گرفتند. در گام بعدی برای به دست آوردن سازه‌های فاژیλ-ZAP-CMV-GFP و نیز pCMV Script GFP، به ترتیب DNA ژنومی مربوط به ذرات فاژی -GFPλو نیز M13-GFP تکثیر شده، استخراج و برای آلوده‌سازی سلول‌های AGS مورد استفاده قرار گرفتند. در نهایت کارآیی انتقال و بیان ژن GFP در سلول‌های AGS توسط دستگاه FACS مورد بررسی قرار گرفت.بررسی میکروسکوپی سلول‌های تیمار شده با ذرات فاژی M13-GFP و نیز نتایج واکنش PCR نشان می‌دهد که درصد کمی از سلول‌های AGS ذرات فاژی مذکور را دریافت نموده‌اند.هم‌چنین بررسی سلول‌های AGS با دستگاه FACS نشان می‌دهد که آن دسته از سلول‌هایی که سازه‌های فاژی-GFPλ-ZAP-CMV را دریافت نموده‌اند در مقایسه با سلول‌هایی که سازه ژنی pCMV Script GFP را دریافت نموده‌اند، نه تنها تعداد سلول‌های GFP مثبت بیشتری نشان می دهند بلکه شدت بیان ژن GFP نیز بیشتر می‌باشد. این نتایج می‌تواند مؤید این مطلب باشد که ناقل‌های ژنی مبتنی بر ذرات فاژی لامبدا به علت ساختار ژنومی DNA دورشته‌ای که دارند، نسبت به تحویل‌دهنده‌های ژنی مبتنی بر فاژ M13 کارآیی بیشتری را در انتقال و بیان ترانسژن از خود نشان می‌دهند.

مقدمه .. 2

1-2 ناقل‌های مورد استفاده در ژن‌درمانی.. 4

1-2-1 ناقل‌های ژنی ویروسی 4

1-2-2 ناقل‌های ژنی غیر ویروسی 6

1-2-3 باکتریوفاژها 7

1-3 باکتریوفاژ لامبدا.. 12

1-3-1 بیولوژی باکتریوفاژ لامبدا 12

1-3-2 ساختار فاژ لامبدا 13

1-3-3 سازماندهی ژنوم فاژ لامبدا 14

1-3-4 چرخه زندگی فاژ لامبدا 15

1-3-5 فاژ لامبدا به عنوان ناقل ژنی 18

1-4 باکتریوفاژ M13.. 22

1-4-1 بیولوژی باکتریوفاژ M13 22

1-4-2 ساختار باکتریوفاژ M13 22

1-4-3 سازماندهی ژنومی باکتریوفاژ M13 24

1-4-4 چرخه زندگی باکتریوفاژ M13 25

1-4-5 فاژ M13 به عنوان ناقل ژنی 27

1-5 اهمیت و اهداف پژوهش.. 31

2-1 روش تهیه محلول‌ها و بافرها.. 31

2-1-1 تهیه محلول 1 مولار تریس 31

2-1-2 تهیه کلرید کلسیم 50 میلی‌مولار 31

2-1-3 تهیه محلول EDTA 0.5 M PH=8.. 32

2-1-4 تهیه SDS10% 32

2-1-5 تهیه بافر TE 32

2-1-6 تهیه TBE 10X 33

2-1-7 تهیه ژل آگارز %1 33

2-1-8 تهیه بافر SM 34

2-1-9 تهیه PBS 34

2-1-10 تهیه تریپسین- EDTA0.25% 35

2-1-11 تهیه پارافرمالدهید % 4 35

2-1-12 تهیه محلول سدیم آزید %01/0 36

2-2 تهیه محیط‌های کشت.. 36

2-2-1 محیط کشت باکتری LB مایع 36

2-2-2 محیط کشت LB مایع همراه با مکمل 37

2-2-3 محیط کشت LB جامد 37

2-2-4 تهیه محیط کشت NZY Agar: 38

2-2-5 تهیه محیط NZY Top Agar: 38

2-2-6 تهیه محیط 2x YT 39

2-3 ناقل‌های مورد استفاده در پژوهش.. 40

2-3-1 ناقل‌‌های فاژی Lambda ZAP®-CMV XR و pCMV Script Ex. 40

2-4 باکتری‌های مورد استفاده در پژوهش.. 42

2-4-1 باکتری E.coli سویه XL1-Blue MRF´. 42

2-4-2 باکتری E.coli سویه XLOLR 42

2-5 کار با رده‌های سلولی.. 43

2-5-1 ساخت محیط کشت 43

2-5-2 افزودن سرم و تهیه محیط کشت کامل 43

2-5-3 انجماد رده‌های سلولی 44

2-6 مراحل انجام پژوهش به صورت گام به گام.. 45

2-6-1 کار با باکتریوفاژ لامبدا 45

2-6-2 کار با باکتریوفاژ M13 52

2-6-3 کشت و پاساژ رده‌ی سلول AGS 58

2-6-4 ترانسفکشن سلول‌های AGS توسط ذرات فاژی M13-GFP 59

2-6-5 استخراج فرم دورشته‌ای همانندساز سازه ژنی pCMV Script GFP. 62

2-6-6 محاسبه تعداد نسخه‌های سازه‌های فاژی λ-ZAP-CMV-GFP و pCMV Script GFP 65

2-6-7 ترانسفکشن سلول‌های AGS توسط سازه‌های فاژی λ-ZAP-CMV-GFP و pCMV Script GFP. 67

2-6-8 بررسی ورود سازه‌های فاژی λ-ZAP-CMV-GFP و pCMV Script GFP به رده سلولی AGS 69

3-1 تأیید سازه ژنی λ-ZAP-CMV-GFP و ذرات فاژی λ-GFP. 71

3-2 تکثیر ذرات فاژی λ-GFP و تعیین تیتر آن.. 72

3-3 ساخت ذرات فاژی M13 حاوی توالی GFP. 73

3-3-1 تأیید کلونی‌های حاوی سازه ژنی pCMV Script GFP. 74

3-3-2 تکثیر ذرات فاژی M13-GFP 75

3-3-3 انتقال و بیان ژن GFP توسط ذرات فاژی M13-GFP 76

3-3-4 بررسی ورود ذرات فاژی M13-GFP به سلول‌های AGS 77

3-3-5 استخراج ssDNA از ذرات فاژی M13-GFP 78

3-3-1 استخراج فرم دورشته‌ای همانندساز ناقل M13-GFP 79

3-4 استخراج λ-DNA.. 80

3-5 محاسبه تعداد نسخه‌های سازه‌های ژنی λ-ZAP-CMV-GFP و pCMV Script GFP. 81

3-6 ترانسفکشن سلول‌‌های AGS توسط سازه‌های استخراج شده از ذرات فاژی M13-GFP و 82

3-6-1 بررسی بیان ژن GFP توسط میکروسکوپ فلورسانس 82

3-6-2 بررسی کارآیی انتقال و بیان ژن GFP توسط دستگاه فلوسیتومتری 84

3-6-3 بررسی شدت بیان ژن GFP در سلول‌های AGS 86

4-1 تهیه ذرات M13-GFP و بررسی کارآیی ترانسفکشن سلول های AGS توسط آنها 89

4-1-1 بررسی انتقال و بیان ژن GFP توسط ذرات فاژی M13-GFP 89

4-1-2 بررسی ورود ذرات فاژی M13-GFP به سلول‌های AGS 90

4-2 بررسی کارآیی انتقال و بیان ترانسژن توسط سازه‌های λ-ZAP-CMV-GFP و pCMV Script GFP 92

4-2-1 بررسی کارآیی انتقال و بیان ژن GFP توسط میکروسکوپ فلورسانس 92

4-2-2 بررسی کارآیی انتقال و بیان ژن GFP به کمک تکنیک فلوسیتومتری 93

4-3 نتیجه‌گیری .. 100

4-4 پیشنهادات .. 100

فهرست منابع 10

شکل 1‑1: نمایی از فاژ لامبدا.. 14

شکل 1-2. سازماندهی ژنوم فاژ لامبدا15

شکل 1-3. چرخه زندگی فاژ لامبدا17

شکل 1-4. نمایی از فاژ M13 24

شکل 1-5. سازماندهی ژنومی فاژ M13 25

شکل1-6. چرخه زندگی فاژ M13 27

شکل 2-1. نقشه ژنی ناقل Lambda-ZAP CMV XR......................................................................................40

شکل 2-2. نقشه سازه ژنی pCMV Script EX و توالی نواحی کلونینگ آن..............................................41

شکل 3-1. تأیید سازه ژنی λ-ZAP-CMV-GFP و ذرات فاژی λ-GFP........................................................71

شکل 3-2. تکثیر ذرات فاژی λ-GFP و تعیین تیتر آن.......................................................................................72

شکل 3-3. نتایج برش و خارج‌سازی درون سلولی ذرات فاژی M13-GFP....................................................73

شکل 3-4. تأیید کلونی‌های حاوی ذرات فاژمیدی M13-GFP.......................................................................74

شکل 3-5. تکثیر ذرات فاژی M13-GFP و تعیین تیتر آن .............................................................................75

شکل 3-6. بررسی انتقال ژن GFP توسط ذرات فاژی M13-GFP..................................................................76

شکل 3-7. بررسی ورود ذرات فاژی M13-GFP به سلول‌های AGS..............................................................77

شکل 3-8. استخراج سازه ژنی pCMV Script GFP از ذرات فاژی M13-GFP…...................................78

شکل 3-9. استخراج فرم دورشته‌ای همانندساز (RF)...................................................................................79

شکل 3-10.استخراج سازه ژنی λ-ZAP-CMV-GFP از ذرات فاژی λ-GFP...........................................80

شکل 3-11. بررسی بیان ژن GFP منتقل شده توسط سازه‌های ژنی مبتنی بر فاژ....................................83

شکل 3-12.بررسی کارآیی انتقال و بیان ژن GFP منتقل شده توسط سازه‌های فاژی..............................85

شکل 3-13. شدت سیگنال‌های فلورسانس سلول‌های GFP مثبت................................................................87

جدول 2-1. دستورالعمل ترانسفکشن سلولی با لیپوفکتامین 2000.................................................................6

فصل اول : مقدمه و بررسی منابع

1-1مقدمه

ژن‌درمانی فرصت‌های زیادی را برای درمان بیماری‌ها از جمله بیماری‌های ژنتیکی، بیماری‌های عفونی و به خصوص انواع سرطان‌ها فراهم می‌کند. ولیکن متأسفانه در مسیر ژن‌درمانی فاکتورهای متعددی بیان گسترده و قابل کنترل ترانسژن را در سلول مورد نظر با مشکل مواجه می‌کند. از این حیث تحویل ژن به سلول هدف یکی از هیجان‌انگیزترین و در عین حال دشوارترین مراحل ژن‌درمانی می‌باشد که علیرغم پیشرفت دانش بشری هم‌چنان با مشکلات بسیاری روبرو است که کاربرد این روش درمانی را در سطح کلینیکی محدود می‌کند. از این‌رو طراحی صحیح ناقل ژنی و بهینه‌سازی بیان ژن نیز در موفقیت ژن‌درمانی نقش بسزایی دارند(1). از مشخصه‌های ژن‌درمانی کارآمد، عدم ایمنی‌زایی و هم‌چنین محافظت از ژن خارجی در برابر سیستم ایمنی میزبان، انتقال هدفمند ژن مورد نظر به سلول هدف و در نهایت بیان مناسب و قابل کنترل آن در سلول هدف می‌باشد(2-4). ناقل‌های ژنی ویروسی و نیز نانوذرات سنتزی غیر ویروسی علیرغم قابلیت‌هایی که در انتقال و بیان ترانسژن دارند، نقاط ضعف بسیاری نیز دارند که سبب شده است دانشمندان در صدد جستجوی یک جایگزین مناسب برای آنها باشند، به این‌ترتیب در دهه‌های اخیر فاژها به عنوان نسل جدیدی از ناقل‌های ژنی مطرح شدند(2). فاژها با توجه به مزایای عملکردی زیادی که دارند به عنوان ناقل‌های مولکولی درمانی مورد توجه بسیاری از محققان قرار گرفته‌اند و یکی از جذاب‌ترین زمینه کاربرد آنها انتقال ژن می‌باشد. دررابطه با ویژگی‌های فاژها می‌توان به ساختار ژنتیکی ساده، عدم تمایل برای ورود به سلول‌های یوکاریوتی، پایداری در شرایط مختلف محیطی و فیزیولوژیکی(5, 6)، محافظت از ژن خارجی و امکان هدفمند کردن ذرات فاژی به کمک تکنیک‌های فاژنمایی(7, 8) و یا اتصال فیزیکی و شیمیایی(9) مولکول‌های هدفمند بر سطح ذرات فاژی اشاره کرد. تا کنون تحقیقات بسیاری بر روی توانایی انتقال ژن توسط فاژها انجام شده است و تحویل‌دهنده‌های ژنی بسیاری مبتنی بر فاژ طراحی شده‌اند. فاژهای M13 و لامبدا با توجه به ویژگی‌های ساختاری که دارند در بسیاری از پروژه‌های تحقیقاتی جهت انتقال ژن‌های درمانی به عنوان مرسوم‌ترین ابزارهای انتقال ژن مبتنی بر فاژ شناخته شده‌اند و تاکنون بررسی‌های بسیاری بر روی عملکرد آنها به عنوان ناقل ژنی انجام شده‌ است و هر دو کارآیی نسبتاً خوبی را از خود نشان داده‌اند.

فاژ رشته‌ای M13، جزء فاژهای لیزوژنیک طبقه‌بندی می‌شود و با ساختار انعطاف‌پذیر و ژنوم تک‌رشته‌ای حلقوی 6407 بازی که دارند، به عنوان ابزارهای کلونینگ و نمایشی دارای مزایایی هستند. ژنوم آنها قادر است بدون اینکه خللی در امر بسته‌بندی آنها ایجاد شود، قطعات ژنی خارجی را تحمل کند. هم‌چنین ژنوم آنها دارای دو فرم تک و دورشته‌ای می‌باشد که به ترتیب برای کلونینگ و ساخت کتابخانه ژنی مفید هستند. فاژ لامبدا نیز یک فاژ دم‌دار و لیتیک می‌باشد که ژنوم خطی دورشته‌ای با طول bp48520دارد. یکی از ویژگی‌های برجسته فاژ لامبدا پذیرش و انتقال قطعات ژنی خارجی تا طول kb15 می‌باشد که این مسئله در کلونینگ و به خصوص برای ساخت کتابخانه‌های پروتئینی و cDNA اهمیت بسیاری دارد(10).

1-2 ناقل‌های مورد استفاده در ژن‌درمانی

1-2-1 ناقل‌های ژنی ویروسی

ویروس‌ها با توجه به ویژگی‌های ساختاری مناسبی که دارند به عنوان یکی از ابزارهای بیوتکنولوژی کارآمد و مؤثر به خصوص در زمینه انتقال ژن معرفی شده‌اند و توجه بسیاری از دانشمندان را به خود جلب کرده‌اند. سیستم‌های انتقال ژن ویروسی که به طور عمده در سطح آزمایشگاهی و گاهاً در سطح کلینیکی مورد استفاده قرار گرفته‌اند، شامل ناقلین مبتنی بر آدنوویروس‌ها، AAV[1]، لنتی ویروس‌ها، رتروویروس‌ها می‌باشند(11). به طور قطع می‌توان گفت که تحویل‌دهنده‌های ژنی ویروسی به عنوان یکی از کارآمدترین ابزارهای انتقال ژن می‌باشند که مکانیسم‌های دقیق و شناخته‌شده‌ای جهت برداشت سلولی، انتقال از سیتوپلاسم به هسته و بیان ترانسژن دارا می‌باشند که در انتخاب ناقل ژنی اهمیت زیادی دارد. هم‌چنین امکان کنترل ویژگی‌های ساختاری و عملکردی ویروس از طریق تغییرات ژنوم آن وجود دارد، به این ترتیب بر خلاف ناقل‌های سنتزی غیرویروسی نه تنها تمامی ذرات ویروسی تولید شده ویژگی‌های ساختاری و عملکردی یکسانی خواهند داشت بلکه هدفمندسازی ناقل‌های ژنی مبتنی بر ویروس‌ها به کمک تکنولوژی DNA نوترکیب نیز میسر خواهدشد. علاوه بر تحویل ژن مورد نظر به سلول هدف، بیان مؤثر آن نیز از اهمیت بسزایی برخوردار است که با انتقال ترانسژن به هسته سلول هدف توسط ناقل‌های ویروسی این امر نیز محقق می‌گردد و در مجموع ابزارهای انتقالی ویروسی نسبت به ناقل‌های سنتتیک کارآیی انتقال ژن بالاتری را از خود نشان می‌دهند(12-14). در ابتدا نیز ژن‌درمانی با تحویل‌دهنده‌های ویروسی به عنوان یک روش مؤثر برای درمان بیماری SCID معرفی شد ولیکن سه سال بعد با مرگ دو بیمار که تحت ژن‌درمانی با ناقلین ویروسی قرار گرفته بودند، اعتماد عمومی را در این زمینه به تزلزل انداخت(15). با این وجود حامل‌های ویروسی علیرغم مزایای ذکر شده معایبی نیز دارند که کاربرد گسترده آنها را در سطح کلینیکی محدود می‌کند. همان‌طور که اشاره شد، طیف خاصی از سلول‌های پستانداران میزبان ویروس‌هایی چون آدنوویروس‌ها و لنتی‌ویروس‌ها می‌باشند، به همین علت ناقلین ویروسی یوکاریوتی تمایل بیشتری برای ورود به این دسته ازسلول‌ها دارند به عنوان مثال سلول‌های ریوی و نیز سلول‌های بخش فوقانی دستگاه تنفسی به عنوان میزبان عمده و اختصاصی آدنوویروس‌ها مطرح می‌شوند و به همین علت مشکلی که در کار با وکتورهای مشتق شده از ویروس‌هایی چون آدنوویروس و لنتی ویروس و غیره وجود دارد این است که حتی در صورت هدفمند سازی، این وکتورها وارد سلول‌های غیر اختصاصی نیز می‌شوند و ادامه درمان با مشکل مواجه خواهد شد. از سویی دیگر می‌توان به شناسایی ویروس‌های یوکاریوتی توسط سیستم ایمنی ذاتی به عنوان پاتوژن و هم‌چنین سیستم ایمنی سلولی در نتیجه بیان پروتئین‌های ویروسی اشاره کرد که باعث کاهش میزان بیان ترانسژن در سلول هدف و نیز عدم امکان تکرار مجدد دوره‌های درمانی می‌شود. هرچند که در نسل‌های جدید وکتورهای ویروسی بخش عمده‌ای از ژنوم ویروسی حذف شده است و پروتئین‌های پاتوژنیک ویروسی بیان نشده و نیز ویروس‌ها به خودی خود توانایی تکثیر ندارند ولیکن در صورت جهش در ژنوم آنها و یا تماس با ویروس‌های وحشی و تغییر نیافته احتمال این وجود دارد که دوباره توانایی تکثیرشان را به دست آورده و مشکلاتی اعم از انتشار ویروس و عفونت‌زایی در بدن بیمار را سبب شوند(1, 2, 16, 17). یکی دیگر از مشکلاتی که در کاربرد ناقلین ویروسی وجود دارد احتمال فعال شدن پروتوانکوژن‌ها در نتیجه ورود تصادفی ژنوم ویروس به ژنوم سلول میزبان می‌باشد و محققان در سال 2007 نشان دادند که تزریق ناقل ژنی ویروسی AAV به موش سبب توسعه و رشد بیشتر تومورهای کبدی شده است(17, 18). از سویی دیگر از نقطه نظر عملی، تولید تجاری ویروس‌های نوترکیب در سلول‌های حیوانی امری دشوار و در عین حال هزینه‌بر می‌باشد. به همین جهت دانشمندان در تلاش هستند تا جهت رفع مشکلات ناشی از انتقال ژن توسط حامل‌های ویروسی نسل جدیدی از ابزارهای انتقال ژن را طراحی و شناسایی کنند.

1-2-2 ناقل‌های ژنی غیر ویروسی

محققان جهت غلبه بر مشکلات ایمنی ناقل‌های ویروسی به سوی طراحی ناقل‌های ژنی غیرویروسی روی آوردند که در ظاهر نسبت به تحویل‌دهنده‌های ویروسی مشکلات کمتری داشته و قابلیت کنترل بهتری را نیز نشان می‌دهند. در مجموع تحویل‌دهنده‌های ژنی غیرویروسی شامل ساختارهای مبتنی بر اسیدنوکلئیک می‌باشند که شباهت زیادی به ترکیبات دارویی رایج دارند و به طور عمده لیپید و یا پلیمرهای کاتیونی جهت بسته‌بندی و نیز انتقال توالی اسیدنوکلئیکی حاوی ترانسژن به سلول هدف مورد استفاده قرار می‌گیرند. به عنوان مثال DNA Complex، لیپوزوم‌ها، کروموزوم‌ مصنوعی در این خانواده طبقه‌بندی می‌شوند. DNA Complex متشکل از توالی DNA اتصال یافته به لیپید، پروتئین، پپتید و یا ناقلین پلیمری نسل جدیدی از ناقلین غیرویروسی می‌باشد. از مزایای این روش انتقال ژن، ظرفیت پذیرش قطعات DNA با اندازه بزرگ می‌باشد(19).

لیپوزوم‌ها نیز شامل وزیکول‌هایی متشکل از دو لایه لیپیدی مشابه غشاء سلول می‌باشد و از طریق برهمکنش با ساختار سطحی غشاء سلول ژن مورد نظر را به سلول هدف می‌رسانند. در رابطه با مزایای لیپوزوم‌ها می‌توان به تولید ساده در مقادیر زیاد، ایمنی‌زایی پایین و عدم ایجاد پاسخ همورال با تکرار تزریق دوباره آنها اشاره کرد(20).

یکی از روش‌های غیرویروسی که اخیراً در حال بررسی است، کروموزوم مصنوعی می‌باشد. کروموزوم مصنوعی می‌تواند با بیان دائمی ژن مارکر و بدون ورود به ژنوم میزبان در خارج از کروموزوم، طی سه نسل به ارث برسد(21). بر خلاف ناقل‌های ویروسی، در این روش محدودیت اندازه در انتقال ژن وجود ندارد. با این وجود ترکیبات غیرویروسی نسبت به ترکیبات ویروسی کارآیی کمتری در انتقال ترانسژن به سلول هدف را از خود نشان می‌دهند و به نظر می‌رسد که موانع خارج سلولی و نیز داخل سلولی هر دو در کاهش کارآیی انتقال ژن آنها مؤثر هستند. در مجموع موانعی که در انتقال ژن توسط ناقلین غیرویروسی وجود دارد شامل بسته بندی DNA، هدفمندسازی حامل ژنی برای سلول هدف، نحوه ورود به سلول، فرار اندوزومی و ورود به هسته می‌باشد. از موانع اصلی داخل سلولی انتقال ژن توسط این دسته از ناقل‌های ژنی این است که ناقل‌های ژنی غیرویروسی بر خلاف ناقل‌های ویروسی توانایی انتقال ترانسژن از سیتوپلاسم به هسته سلول را ندارند و تنها در سلول‌های در حال تقسیم عملکرد نسبتاً خوبی را در ورود به هسته و انتقال کارآمد و پایای ژن از خود نشان می‌دهند. هم‌چنین میزان سمیت ناقل‌های ژنی غیرویروسی نیز در روند درمان مشکل‌ساز می‌باشد و بر اساس مشاهدات انجام شده در ساختار DNA Complex، پلی‌کاتیون‌هایی با وزن مولکولی پایین مثل چیتوزان و پلی‌اتیلن‌ایمین(PEI) میزان سمیت کمتری نسبت به پلی‌کاتیون‌هایی با وزن مولکولی بالاتر دارند و اغلب پلی‌کاتیون‌ها از ترکیبات کاتیونی طبیعی انتخاب می‌شوند تا میزان ایمنی‌زایی آنها تا حد ممکن کاهش پیدا کند(22, 23). در نهایت با توجه به محدودیت‌های ذکر شده در سیستم تحویل ژن غیر ویروسی و هم‌چنین بازدهی پایین‌تری که نسبت به ناقل‌های ویروسی دارند، موانع زیادی در راستای توسعه این سیستم به یک سیستم کاربردی در سطح کلینیکی وجود دارد که نیاز به پژوهش و بررسی بیشتری دارند.

1-2-3باکتریوفاژها

باکتریوفاژها به عنوان ویروس‌های پروکاریوتی با فراوانی حدود10³⁰ تا 10³² از نظر تنوع جزء سفراوان‌ترین موجودات کره زمین محسوب می‌شوند و نقشی حیاتی در ایجاد تعادل در جمعیت میکروبی موجود بر روی کره زمین ایفا می‌کنند. باکتریوفاژها در تمام نقاط کره زمین از جمله در اقیانوس‌ها، خاک، اعماق دریاها، در آبی که می‌نوشیم و هم‌چنین غذایی که می‌خوریم وجود دارند. در غذاهای تخمیری مثل ماست یافت می‌شوند و بدون عوارض جانبی و خطرناکی از طریق دهان وارد بدن می‌شوند(1). پس از شناسایی فاژها توسط Twortدر سال 1915 و نیز dHrelleدر سال1917، تحقیقات گسترده‌ای بر روی فاژها انجام شد که زمینه‌ساز پیشرفت‌های حیاتی و بزرگی در زمینه علوم زیستی بوده است و به این ترتیب فاژها نقشی اساسی در شناسایی DNA به عنوان ماده ژنتیکی، تشخیص و شناسایی ژن‌ها و حتی شناسایی mRNA به عنوان واسطه‌ای برای تولید پروتئین‌ها ایفا کرده‌اند و با کمی وقفه در سال‌های بعد از جنگ جهانی دوم و در حال حاضر نیز در مراحل مختلف تشخیص و درمان بیماری‌ها به عنوان اجزای شناساگر بیوسنسورها، ترکیبات ضد باکتریایی، ابزارهایی برای انتقال ژن، واکسن و دارو نیز مورد استفاده قرار می‌گیرند(1, 24, 25). با توجه به ویژگی‌های مناسبی که باکتریوفاژها نسبت به سایر تحویل‌دهنده‌های ژنی ویروسی و غیرویروسی دارند، به عنوان یک ابزار انتقال ژن مناسب مورد توجه بسیاری از دانشمندان قرار گرفته‌اند و تعداد زیادی از ناقل‌های مبتنی بر فاژها طراحی و مورد بررسی قرار گرفته‌اند.

آنچه که در طراحی یک ناقل ژنی از اهمیت بسیاری برخوردار است، پایداری فیزیکی ناقل ژنی می‌باشد. چرا که در صورت عدم پایداری کافی در شرایط فیزیولوژیکی و محیطی مختلف، کارآیی چندانی نخواهد داشت و کاربرد آن محدود خواهد شد. براساس تحقیقاتی که انجام شده‌ است، فاژها در محدوده (11-3)PH پایداری بسیار خوبی را از خود نشان می‌دهند و از آنجایی که دانشمندان در تلاش هستند تا از انتقال دهانی فاژ برای ژن‌درمانی و نیز انتقال واکسن استفاده کنند این موضوع اهیمت دو چندانی پیدا می‌کند. هم‌چنین در محیط آزمایشگاهی فاژها در حضور و عدم حضور پایدار کننده‌هایی همچون DMSO برای حدود 100 دوره یخ‌زدایی[2] پایدار هستند و تا 65 روز کاهش تیتر قابل ملاحظه‌ای نخواهند داشت. علاوه بر این بر خلاف سایر تحویل دهنده‌های ژنی ویروسی و غیرویروسی فاژها بدون این‌که کاهش تیتر قابل ملاحظه‌ای از خود نشان دهند، به صورت محلول در بافر و آب مقطر و یا به صورت خشک شده با تکنیک freeze-dried ، قابل نگهداری در محیط آزمایشگاه می‌باشند. نکته قابل توجه دیگر در رابطه با فاژها این است که نسبت به تغییرات دمایی در بازه‌های زمانی کوتاه مدت حساسیت چندانی ندارند و کاهشی در تیتر آنها مشاهده نخواهد شد(5, 26, 27).

فاژها به علت این‌که تنها سلول‌های باکتریایی را آلوده می‌کنند، جزء ناقل‌های ویروسی پروکاریوتی دسته‌بندی می‌شوند و بر خلاف ناقل‌های ویروسی یوکاریوتی که تنها سلول‌های یوکاریوتی و به خصوص سلول‌های پستانداران را آلوده می‌کنند، تکثیر ساده‌تری دارند، چرا که تکثیر آنها تنها وابسته به سلول‌های پروکاریوتی است به عنوان مثال دو فاژ لامبدا و M13 از فاژهایی هستند که در اکثر زمینه‌های بیوتکنولوژی مورد استفاده قرار می‌گیرند؛ فاژ لامبدا یک فاژ لیتیک محسوب می‌شود و پس از این‌که فاژ حاوی ترانسژن به محیط کشت حاوی باکتری افزوده شد از طریق گیرنده‌های اختصاصی فاژ، موجود در سطح سلول باکتری وارد باکتری شده و پس از تکثیر ژنوم فاژ و نیز سنتز پروتئین‌های پوششی آن، بسته بندی فاژ لامبدا انجام شده و فاژهای حاصل از طریق لیز سلول باکتری در محیط آزاد می‌شوند(28). فاژ M13 ، یک فاژ رشته‌ای است و جزء فاژهای لیزوژنیک دسته‌بندی می‌شود(29). تکثیر ابزارهای انتقالی ژنی مشتق شده از این فاژ نیز به این شکل است که پس از این‌که از طریق گیرنده‌های اختصاصی خود در سطح سلول باکتری وارد سلول باکتری شد به شکل پلاسمید در سیتوپلاسم سلول باکتری باقی می‌ماند و پس از افزودن فاژ کمکی به محیط کشت حاوی این ناقل‌های ژنی و تأمین پروتئین‌های پوششی مورد نیاز، بسته بندی آنها انجام شده و بدون این که سلول باکتری میزبان را از بین ببرند، از سلول باکتری خارج می‌شوند(30). پس همان‌طور که ذکر شد فاژها از حیث تکثیر ساده‌تری که نسبت به ناقل‌های ویروسی یوکاریوتی دارند کاربرد گسترده‌تری خواهند داشت(7). به این ترتیب تولید و تخلیص انبوه، ساده و کم‌هزینه یکی دیگر از مزایای تحویل‌دهنده‌های ژنی مبتنی بر فاژها تلقی می‌گردد و هنگام طراحی ناقلین ژنی مد نظر قرار می‌گیرد. از سویی دیگر باکتریوفاژها به خصوص فاژ M13 ساختار ژنتیکی ساده‌ای دارند و به همین علت دستکاری ژنتیکی آنها در جهت تولید ناقل‌های ژنی کارآ و مؤثر، راحت‌تر و ساده‌تر خواهد بود. یکی دیگر از نکات قابل توجه در مورد فاژها این است که به علت این‌که فاژها به عنوان حامل‌های ویروسی پروکاریوتی مطرح می‌شوند، پس می‌توان گفت که حتی با حذف بخش بزرگی از ژنوم فاژها باز هم توانایی ورود به سلول یوکاریوتی تحت درمان و نیز انتقال ترانسژن را خواهند داشت. به عنوان مثال یکی از ویژگی‌هایی که فاژ M13 دارد این است که ساختار DNA تک‌رشته‌ای دارد و محققان برای ساخت حامل‌های ژنی که همین ساختار را داشته باشند ناحیه شروع همانندسازی از این فاژ را به ساختار پلاسمید اضافه می‌کنند و فاژمید به عنوان یک ناقل ژنی سنتز می‌شود که در سلول یوکاریوتی میزبان به صورت تک‌رشته‌ای خواهد بود(1, 31). یکی دیگر از ناقل‌های ژنی که به این روش ساخته می‌شود کاسمیدها هستند. ساخت کاسمید ها به این ترتیب است که نواحی cos از فاژ لامبدا به ساختار پلاسمید PBR322 اضافه می‌شود و این ناقل ژنی کاسمیدی که به این روش سنتز می‌شود علاوه بر این‌که ویژگی‌های یک پلاسمید را دارد و شبیه به پلاسمید رفتار می‌کند، ویژگی‌های فاژ لامبدا را نیز دارا بوده و پس از سنتز، از نواحی cos برش می‌خورد و در نهایت توسط پروتئین‌های پوششی فاژ بسته‌بندی می‌شود(31).

یکی از شاخصه‌های بارز تحویل‌دهنده‌های ژنی فاژی ظرفیت بالای پذیرش ژن خارجی می‌باشد. بخش بزرگی از ژنوم فاژ مربوط به ورود به سلول‌های پروکاریوتی و تکثیر در این سلول‌ها می‌باشد، به این ترتیب با حذف این دسته از ژن‌ها از ژنوم فاژ نه تنها ظرفیت پذیرش ژن خارجی افزایش می‌یابد بلکه تأثیری در میزان عفونت‌زایی فاژ نخواهد داشت. در صورتی که ناقل‌های ویروسی یوکاریوتی ظرفیت پایینی برای پذیرش ژن خارجی دارند و این موضوع یکی دیگر از محدودیت‌های کار با این دسته از ناقلین ژنی محسوب می‌گردد. به عنوان مثال آدنوویروس(kb8)، لنتی ویروس (kb10-8) و AAV (kb7/4) ظرفیت پذیرش ژن خارجی را دارند. در صورتی که فاژ لامبدا قادر به انتقال حدود kb15 است. هم‌چنین باکتریوفاژ M13 نیز به نظر می‌رسد که محدودیتی برای انتقال ژن ندارد. این ظرفیت بالای پذیرش ژن خارجی در فاژها اجازه انتقال همزمان توالی‌های حفاظتی پستانداران را نیز می‌دهد و با این وجود کنترل بیان ژن نیز به شکل ساده‌تری انجام خواهد شد(11, 32).

یکی از مهم‌ترین اهداف ژن‌درمانی، هدفمندکردن ابزارهای انتقال ژن به سلول‌های منفرد ویا بافت‌های اختصاصی است و نیز البته یکی از دشوارترین و سخت‌ترین مراحلی است که دانشمندان هنگام کار با انواع مختلف ناقل‌های ژنی با آن روبرو هستند. در صورتی که ترانسژن مورد نظر وارد سلولی غیر از سلول هدف شود عملکرد طبیعی سلول مختل شده و نتایج عکس خواهد داد و به خصوص این موضوع در ژن‌درمانی انواع مختلف سرطان‌ها اهمیت دوچندانی پیدا می‌کند و به عنوان یک نیاز اساسی تلقی می‌گردد، چرا که گاهاً ناقل‌های ژنی حامل ترانسژنی می‌باشند که محصول پروتئینی آن برای سلول سرطانی سمی بوده و سبب مرگ سلولی می‌شود. همان‌طور که اشاره شد، طیف خاصی از سلول‌های پستانداران میزبان ویروس‌هایی چون آدنوویروس و لنتی‌ویروس می‌باشند، به همین علت ناقل‌های ویروسی یوکاریوتی تمایل بیشتری برای ورود به این دسته ازسلول‌ها دارند ولیکن فاژهای وحشی به عنوان ویروس‌های پروکاریوتی توانایی آلوده کردن سلول‌های یوکاریوتی را ندارند و تنها در صورتی که هدفمند شوند با کارآیی بسیار بالایی ترانسژن را به سلول هدف منتقل می‌کنند. از این حیث یکی از جذاب‌ترین جنبه‌های کار با تحویل دهنده‌های ژنی مبتنی بر فاژها هدفمندسازی ساده و مؤثر آنها جهت افزایش کارآیی انتقال ژن می‌باشد(6, 33, 34). در این راستا مزیتی که فاژها نسبت به سایر ویروس‌ها دارند این است که هیچ‌گونه تمایلی برای ورود به سلول‌های پستانداران نداشته و در نتیجه درمان با اطمینان خاطر بیشتری انجام خواهد شد و سایر سلول‌ها آلوده نمی‌شوند. هدفمند سازی فاژها به دو روش فاژنمایی[3] و نیز اتصال شیمیایی و یا فیزیکی لیگاندهای اختصاصی به سطح ذرات فاژ[4] انجام می‌شود(7, 28, 35). در تکنیک فاژنمایی توالی DNA مربوط به یک لیگاند اختصاصی گیرنده خاص در سطح سلول هدف، به ژنوم فاژ وارد شده و در نهایت این لیگاند به صورت ادغام با پروتئین‌های پوششی فاژ در سطح فاژ نمایان می‌شود و فاژ مربوطه منحصراً به گیرنده‌های سطح سلول هدف متصل شده و وارد سلول می‌شود(7, 35). بر این اساس کتابخانه‌های فاژی متشکل از میلیون‌ها کلون حامل پپتید و یا پروتئین‌های مختلفی تشکیل خواهد شد که با تکنیک فاژنمایی در سطح فاژ ارائه شده‌اند و بر حسب بافت هدف درمان، مورد غربالگری قرار می‌گیرند(36). در تکنیک اتصال شیمیایی نیز لیگاندهای اختصاصی گیرنده‌های موجود در سلول هدف به طور شیمیایی یا فیزیکی به سطح تحویل‌دهنده‌های فاژی متصل می‌شوند و در نهایت ورود هدفمند و اختصاصی ناقل فاژی را به سلول هدف خواهیم داشت و بیان ترانسژن تنها در سلول هدف مشاهده خواهد شد و سایر سلول‌ها تحت تأثیر قرار نمی‌گیرند(28). بر این اساس که این روش هدفمندسازی نیازی به تغییرات ژنتیکی فاژ ندارد، نسبت به تکنیک فاژنمایی راحت‌تر و ساده‌تر خواهد بود.فاژها با توجه به مزایایی که دارند به عنوان یک تحویل دهنده مولکولی جذاب، جهت طراحی تعداد زیادی ابزارهای انتقال ژن، دارو و واکسن مورد استفاده قرار گرفته‌اند. دو نوع ناقل ژنی مشتق شده از فاژ لامبدا و نیز فاژ M13، به عنوان مرسوم‌ترین تحویل‌دهنده‌های ژنی فاژی به عنوان یک ابزار انتقالی در ژن‌درمانی مورد استفاده قرار می‌گیرند.

1-3 باکتریوفاژ لامبدا

1-3-1 بیولوژی باکتریوفاژ لامبدا

لامبدا یک فاژ معتدل است و دارای دو چرخه زندگی لیتیک و لیزوژنیک می‌باشد. ژنوم لامبدا شامل DNA دورشته‌ای خطی با طول bp 48520 می‌باشد که در پوشش پروتئینی فاژ به صورت یک مولکول دورشته‌ای خطی با دو انتهای تک‌رشته‌ای با طول 12 نوکلئوتید بوده که این نواحی تک‌رشته‌ای با عنوان نواحی COS نام‌گذاری می‌شوند. شکل تاخوردگی[5] پروتئین‌های کپسیدی و نیز تشابه فرآیند همانندسازی و بسته‌بندی DNA نشان می‌دهد که فاژهای دم‌دار[6] از جمله فاژ لامبدا و ویروس‌ یوکاریوتی هرپس[7] یک جد مشترک دارند و انتظار می‌رود که فاژ لامبدا عملکرد و نیز کارآیی مشابه با هرپس ویروس داشته باشد(24, 37).

1-3-2 ساختار فاژ لامبدا

حدود 95 درصد از فاژها شامل فاژهای دم‌دار و از راسته کادوویرال[8] می‌باشند. نیمی از جرم ویریون این فاژها را پروتئین و نیمی دیگر را ژنوم که DNA دورشته‌ای است تشکیل می‌دهد. پوشش پروتئینی این فاژها از یک ناحیه سر و یک ناحیه دم تشکیل شده است. فاژهای متعلق به این راسته به سه خانواده اصلی تقسیم بندی می‌شوند و 60% آنها در خانواده سیفوویریده[9]، 25% در خانواده میوویریده[10] و 15% نیز در خانواده پودوویریده[11] قرار می‌گیرند. فاژ لامبدا نیز جزء خانواده سیفوویریده می‌باشد که از جمله شاخصه‌های بارز آنها می‌توان به دم بلند و انعطاف‌پذیر با طول 75 نانومتر و قطر 12 نانومتر اشاره کرد. از اتصال یک دم مارپیچی بلند و انعطاف‌پذیر به یک ساختار 20 وجهی با قطر 55 نانومتر، کپسید فاژ لامبدا شکل می‌‌گیرد. هنگام بسته‌بندی فاژ داخل سلول باکتری پروتئین gpE با تعداد 415 نسخه و با آرایش سه‌تایی بر روی داربست پروتئینی gpC و gpNu1 قرار گرفته و پروکپسید حاصل می‌شود و در مرحله بعدی به کمک کمپلکس ترمیناز و پروتئین gpF1 ژنوم فاژ وارد ساختار پروکپسید شده و پروتئین gpD نیز با تعداد420 ‑ 405 نسخه و با آرایش پنج‌تایی و یا شش‌تایی در سطح کپسید افزوده شده و در نهایت با اتصال دم فاژ به این ساختار 20 وجهی یک ذره فاژی کامل شکل می‌گیرد. بخش لوله‌ای شکل دم فاژ نیز شامل 32 ساختار دیسک مانند می‌باشد که هر دیسک نیز خود از 6 پروتئین gpV که پروتئین عمده ناحیه دم می‌باشد، تشکیل شده ‌است(شکل1-1 )(7, 38).

1-3-3سازماندهی ژنوم فاژ لامبدا

سازماندهی ژنوم فاژ لامبدا به شکلی است که ژن‌هایی که از نظر عملکردی به یکدیگر مرتبط هستند به صورت خوشه‌ای کنار هم قرار گرفته‌اند که این نکته در طراحی ناقلین ژنی مشتق از فاژ لامبدا بسیار حائز اهمیت می‌باشد. نقشه ژنی فاژ لامبدا به طور کلی به سه ناحیه بازوی چپ، بازوی میانی و بازوی راست تقسیم می‌شود. بازوی چپ از ژن Nu1 تا ژن J را در بر گرفته و کدکننده پروتئین‌های مسئول بسته‌بندی ژنوم فاژ داخل پروکپسید و در نهایت ایجاد یک ویریون کامل می‌باشند. بازوی میانی که شامل ژن‌های J تا gam می‌باشد و کد کننده پروتئین‌های مسئول نوترکیبی ژنوم فاژ و نیز پروتئین‌های القاء کننده چرخه لیزوژنی می‌باشند و پروتئین‌های مربوط به ژن‌های gam تا Rz در ناحیه بازوی راست نیز در راستای جلوگیری از آلودگی مجدد سلول E.coli با سایر فاژها، تنظیم چرخه لیتیک، همانندسازی ژنوم فاژ و لیز سلول میزبان عمل می‌کنند(شکل 1-2)(38, 39).

شکل1-2. تصویری از ساختار ژنوم فاژ لامبدا و موقعیت‌های ژن‌های مختلف آن (40)

1-3-4چرخه زندگی فاژ لامبدا

فاژها بر اساس چرخه زندگی به دو گروه فاژهای معتدل[12] و فاژهای ویرولانت[13] تقسیم‌بندی می‌شوند. فاژ لامبدا از فاژهای معتدل بوده و دارای دو فاز لیتیک و لیزوژنیک می‌باشند. در فاز لیزوژنیک، ژنوم فاژ پس از تزریق به سلول میزبان وارد کروموزوم باکتری شده و گاهاً نیز به صورت پلاسمید در سیتوپلاسم باکتری باقی می‌ماند و ژنوم فاژ همراه با ژنوم سلول میزبان تکثیر شده و به زاده‌های حاصل نیز منتقل می‌شود، در این حالت به ژنوم فاژ موجود در سلول باکتری پروفاژ و به سلول‌های باکتری که حاوی پروفاژ هستند لیزوژن گفته می‌شود. در صورتی‌که شرایط نامساعد باشد فاژ وارد چرخه لیتیک شده و پس از تکثیر و بسته‌بندی توسط پروتئین‌های پوششی، لیز سلول باکتری اتفاق افتاده و تعداد زیادی ذرات فاژی در محیط کشت آزاد می‌‌شوند.

به طور کلی چرخه زندگی فاژ لامبدا به سه مرحله تقسیم می‌شود:

1. مرحله ابتدایی[14] 2. مرحله میانی[15] 3. مرحله تأخیری[16]

زمانی که فاژ لامبدا باکتری E.coli را آلوده می‌کند، مولکول DNA خطی به داخل سلول میزبان تزریق شده و سپس به کمک آنزیم‌های لیگاز و ژیراز سلول میزبان نواحی COS بایکدیگر جفت شده و یک مولکول DNA حلقوی تشکیل خواهد شد که الگویی برای ماشین همانندسازی و رونویسی سلول باکتری خواهد بود. در مرحله ابتدایی رونویسی از روی پروموترهای P_L و P_R آغاز شده و به ترتیب پروتئین‌های N و Cro ترجمه می‌شوند. با بیان پروتئین Cro به میزان کافی و تجمع این پروتئین در اپرون‌های مربوط به P_L و P_R، رونویسی از روی ژن‌های ناحیه ابتدایی مهار شده و بیان آنها متوقف می‌‌شود. پروتئین N نیز به عنوان یک آنتی‌ترمیناتور عمل کرده و مانع خاتمه رونویسی در توالی‌های ترمیناتور t_L و t_R می‌‌شود و رونویسی از روی ژن‌های هر دو فاز لیتیک و لیزوژنیک ادامه پیدا می‌کند. یکی از ژن‌هایی که نقشی حیاتی در پیشبرد چرخه لیزوژنی دارد ژن CII می‌باشد؛ بر حسب ژنوم فاژ، شرایط آلودگی و شرایط سلول میزبان، در صورتی که در تعداد نسخه‌های زیادی بیان شود باعث فعال شدن رونویسی از روی پروموترهای Pi- PRE- PAQ می‌شود و در صورت عدم فعال‌سازی پروموترهای فوق توسط پروتئین CII چرخه لیتیک به عنوان مسیر از پیش تعریف شده ادامه پیدا می‌کند. در نهایت رونویسی از ژن Q باعث ورود به مرحله تأخیری و رونویسی از روی ژن‌های مسئول بسته‌بندی فاژ و لیز سلولی می‌شود. برای تکمیل چرخه لیتیک نیاز به همانندسازی از ژنوم فاژ می‌باشد. مولکول DNA دورشته‌ای حلقوی به عنوان الگو عمل کرده و همانندسازی ژنوم فاژ در دو جهت آغاز شده و ساختار تتا تشکیل می‌شود و پس از گذشت 5 تا 15 دقیقه همانند سازی به شیوه حلقه غلتان ادامه پیدا می‌کند و در نهایت یک رشته کانکاتامر شکل می‌گیرد که از تعداد زیادی توالی‌هایی با طول bp48502 تشکیل شده است که از نواحی COS به یکدیگر متصل شده‌اند. هنگام بسته‌بندی ژنوم فاژ، با عملکرد کمپلکس پروتئینی ترمیناز متشکل از پروتئین‌های gpA و نیز gpNu1، مولکول DNA از نواحی COS برش خورده و در پوشش پروتئینی فاژ قرار می‌گیرد. سپس پروتئین‌های ناحیه دم نیز به پروتئین‌های ناحیه سر متصل شده و یک ذره فاژی کامل شکل می‌گیرد و در نهایت تعداد زیادی ذرات فاژ در محیط آزاد می‌شوند(شکل 1-3)(24, 38, 39, 41).

شکل 1-3. نمایی از چرخه زندگی فاژ لامبدا (42)

1-3-5فاژ لامبدا به عنوان ناقل ژنی

بعد از معرفی فاژ لامبدا به عنوان تحویل‌دهنده ژنی در سال 1970 این فاژ نقش مهمی در کلونینگ ایفا کرده‌ است. بخش بزرگی از ناحیه مرکزی باکتریوفاژ لامبدا مربوط به ورود ژنوم فاژ به کروموزوم باکتری میزبان می‌باشد و بدون اینکه تأثیری بر میزان عفونت‌زایی فاژ داشته باشد، قابل حذف بوده و ناقل‌های فاژی مبتنی بر لامبدا بر اساس حذف و یا جایگزینی این قطعه از ژنوم فاژ طراحی می‌شوند. از این‌رو ظرفیت نسبتاً بالای پذیرش ژن خارجی(حدود kb15)، محافظت از ترانسژن در برابر تجزیه محیطی(9)، امکان انتقال از طریق دهان(26) و هم‌چنین آلوده‌سازی مؤثر سلول میزبان و نیز ابعاد این فاژ که از نظر سایز شباهت زیادی به ویروس‌های یوکاریوتی DNA دار دارد(37)، ناقل‌های مشتق از فاژ لامبدا را به یکی از جذاب‌ترین ناقل‌های ژنی تبدیل نموده‌‌ است. برای نخستین بار در سال 1996 نشان داده شد که فاژ لامبدا در صورت هدفمندسازی با پپتید یا پروتئین‌های اختصاصی سلول هدف، قابلیت انتقال ژن به سلول‌های یوکاریوتی را خواهد داشت(41). پس از آن نیز با تغییراتی که جهت هدفمندسازی ذرات فاژی توسط پروتئین‌های پوششی ناحیه سر (gpD) و نیز ناحیه دم (gpV) انجام شد، روند انتقال ژن توسط این دسته از تحویل‌دهنده‌های ژنی بهبود پیدا کرد. با در نظر گرفتن چالش‌هایی که در مسیر انتقال ژن وجود دارد و نیز ویژگی‌های جالب توجه فاژها، این امر یک موفقیت بزرگ در زمینه ژن‌درمانی محسوب می‌شد و پس از آن تلاش جهت افزایش کارآیی انتقال ژن توسط فاژها ادامه پیدا کرد و در این راستا محققان تا کنون به نتایج بسیار خوبی دست پیدا کرده‌اند.

همانطور که ذکر شد، فاژهای وحشی تمایل بسیار کمی را برای ورود به سلول‌های یوکاریوتی از خود نشان داده‌اند(43)، به همین علت در طراحی تحویل‌دهنده‌های ژنی مبتنی بر فاژ هدفمندسازی آنها از اهمیت بسزایی برخوردار است و این دسته از ناقل‌های ژنی تنها در صورت هدفمندسازی، توانایی ورود به سلول‌های یوکاریوتی را دارند و این مسئله یکی دیگر از مزایای فاژها محسوب می‌شود، چرا که دیگر با مشکل ورود غیر اختصاصی فاژ به سایر سلول‌ها روبرو نخواهیم بود. بدین‌ترتیب از گذشته تا کنون تحقیقات بسیاری بر روی اتصال شیمیایی، فیزیکی و یا ژنتیکی لیگاندهای اختصاصی سلول هدف بر سطح فاژ انجام شده است. فاژ لامبدا بر خلاف فاژهای رشته‌ای به علت فرآیند بسته‌بندی داخل سیتوپلاسمی که دارد به عنوان گزینه مناسبی برای ارائه پروتئین‌های بزرگ و پیچیده در سطح فاژ محسوب می‌شود چرا که توالی‌های پروتئینی کامل، به علت ساختار پیچیده‌ای که دارند تاخوردگی[17] آنها در داخل سیتوپلاسم انجام می‌شود تا در نهایت ترکیب پروتئینی فعالی داشته باشیم. بر این اساس کتابخانه‌های ژنومی و یا cDNA مبتنی بر فاژ لامبدا سنتز شده‌اند و از طریق غربالگری این کتابخانه‌های فاژی با روش‌های درون‌تنی[18] و برون‌تنی[19] و با توجه به ارتباط مستقیم بین فنوتیپ و ژنوتیپ در روش فاژنمایی، لیگاند اختصاصی سلول هدف شناسایی شده و در فرآیند انتقال ژن جهت هدفمندسازی انواع ابزارهای انتقال ژن مورد استفاده قرار می‌گیرد(44-47). در سال 2011 گزارشی مبنی بر هدفمندسازی ذرات فاژی به کمک اتصال شیمیایی لیگاندهای اختصاصی سلول هدف بر سطح ذرات فاژی ارائه شد. در این پژوهش مولکول‌های هولوترانسفرین با روش اتصال شیمیایی به پروتئین‌های پوششی سطح فاژ متصل شده و در نهایت بیان ژن گزارشگر GFP در سلول‌های هدف تا سطح %72/6 افزایش پیدا کرد که نسبت به سایر روش‌های هدفمندسازی، بازدهی بیشتری را در انتقال ترانسژن نشان داده است(9).

فرآیند افزایش بیان وابسته به آنتی‌بادی نوعی پدیده متناقض است که آنتی‌بادی‌های اختصاصی ویروسی موفق به خنثی‌سازی کامل ویروس نمی‌شوند و در مقابل ورود ویروس را به داخل سلول‌های خونی تسهیل می‌کنند. در این حالت کمپلکس فاژ و آنتی‌بادی IgG به رسپتورهای FcγRموجود در سطح سلول‌های خونی متصل شده و تحویل‌دهنده‌های ژنی از طریق اندوسیتوز وابسته به رسپتور وارد سلول شده و در نهایت ذرات ویروسی دو سرنوشت می‌توانند داشته باشند. در حالت اول توسط آنزیم‌های لیزوزومی تجزیه شده و غیر فعال می‌شوند و در حالت دوم ذرات ویروسی در سیتوپلاسم آزاد شده و ترانسژن را به هسته سلول منتقل می‌کنند که این فرآیند تحت عنوان افزایش بیان وابسته به آنتی‌بادی شناخته می‌شود. با توجه به مطالعات انجام شده افزایش بیان وابسته به آنتی‌بادیدر مورد فاژها نیز صادق است و در کنار هدفمندسازی ذرات فاژی با دو روش ذکر شده، این روش نیز می‌‌تواند در افزایش بازدهی انتقال ژن به سلول‌های خونی نقش مهمی ایفا کند(48).

متأسفانه در ارتباط با مسیر انتقال ژن توسط فاژها در داخل سلول تا کنون مکانیسم دقیقی ارائه نشده است ولیکن در مطالعات متعدد انجام شده از سوی دانشمندان مشخص شده است که در صورت تأثیر مهار کننده‌های پروتئازومی، پروتئازهای لیزوزمی و عوامل افزایش دهنده PH داخل لیزوزم سلول هدف، میزان بیان ترانسژن افزایش پیدا می‌کند و گویای این مطلب است که حاملین فاژی پس از ورود به داخل سلول از طریق اندوسیتوز، وارد واکوئل‌های اندوزومی و سپس وارد لیزوزوم شده و در نهایت تعدادی از فاژها تجزیه شده و موفق به انتقال ترانسژن به هسته سلول نمی‌شوند و تنها تعدادی ذره فاژی که هنگام آزادسازی از لیزوزوم ساختار کامل خود را حفظ می‌کنند موفق به انتقال ژن موردنظر به هسته سلول می‌شوند(49-51). پس از خروج ذرات فاژی کامل از لیزوزوم یکی دیگر از مسائلی که در رابطه با انتقال ژن بسیار مهم جلوه می‌کند، ارسال مؤثر ترانسژن از سیتوپلاسم به هسته سلول می‌باشد. بدین ترتیب هدفمندسازی وکتورهای فاژی برای ورود به هسته سلول نیز تا حدی ضرورت پیدا می‌کند. بر خلاف غشاء سلول، غشاء هسته به عنوان یک سد انتخابی برای ورود ماکرومولکول‌هایی بزرگ‌تر از kDa40عمل می‌کند .ماکرومولکول‌هایی که از سد غشاء هسته عبور می‌کنند و وارد هسته سلول می‌شوند، دارای یک توالی پپتیدی به نام NLS می‌باشند که پس از تعامل با کمپلکس منفذ هسته پروتئین مربوطه را به داخل هسته وارد می‌کند که ناقلین ویروسی همچون آدنوویروس‌ها، لنتی‌ویروس‌ها و ... نیز این توالی را دارا می‌باشند. اخیراً محققان در تلاش هستند تا از روشی استفاده کنند که بتوانند با بهره‌گیری از پپتیدهای ویروسی، از آنها در ساختار ناقل‌های غیرویروسی استفاده کنند. در این راستا جهت ارسال ژنوم فاژ به هسته سلول و افزایش کارآیی انتقال ژن، با کمک تکنیک فاژنمایی توالی پپتیدی NLS از پپتید آنتی‌ژن T در ویروس SV40، را در سطح فاژ ارائه نموده و شاهد افزایش بیان ژن در سلول هدف بودند(12). از آنجایی که امکان ارائه همزمان دو پپتید بر سطح ذرات فاژی وجود دارد، می‌توان به طور همزمان حاملین فاژی را برای ورود به سلول و بعد برای ورود به هسته سلول مورد نظر، هدفمند نمود. در پژوهشی که در سال 2006 توسطLankes و همکارانش انجام شد، متوجه شدند که ذرات فاژی هدفمند شده برای اتصال به گیرنده‌هایavb3نسبت به ذرات فاژی وحشی حدود 100 برابر افزایش ورود به داخل سلول را نشان می‌دادند در صورتی که تنها 3 برابر افزایش بیان ترانسژن مشاهده می‌شد و این موضوع تأییدی دیگر بر موضوع هدفمندسازی ذرات فاژی برای ورود به هسته و افزایش بیان ترانسژن می‌باشد (52).

پس از ورود نانوذرات فاژی هدفمند به داخل سیتوپلاسم، قبل از ارسال این ذرات به هسته سلول و انتقال ژنوم فاژ به داخل هسته تعدادی از ذرات فاژی توسط پروتئازهای لیزوزومی و هم‌چنین توسط کمپلکس پروتئازومی موجود در سیتوپلاسم تجزیه شده و در نهایت تعداد کمتری از حامل‌های فاژی موفق به انتقال محتویات ژنومی خود به داخل هسته می‌شوند و با کاهش کارآیی بیان ژن روبرو خواهیم شد(50). از این حیث مهار پروتئازها می‌تواند تأثیری شگرف بر افزایش میزان بیان ترانسژن داشته باشد. یک روش جهت دستیابی به این امر، ارائه مهارکننده‌های پروتئازومی بر سطح ذرات فاژی به کمک تکنیک فاژنمایی می‌باشد(51).مثال‌های ذکر شده همگی حکم تأییدی بر کارآیی بالای فاژ لامبدا به عنوان یک ابزار انتقال ژن می‌باشدکه البته همانند سایر ناقل‌های ژنی برای کاربرد در بالین نیاز به بررسی و آزمایشات بیشتری دارد.

1-4 باکتریوفاژ M13

1-4-1 بیولوژی باکتریوفاژ M13

باکتریوفاژ M13 جزء فاژهای رشته‌ای و ساده طبقه‌بندی می‌شود و توسط پیلی به عنوان گیرنده، باکتری E.coli را آلوده می‌کند. ژنوم این باکتریوفاژ شامل یک DNA تک‌رشته‌ای است که در یک پوشش پروتئینی قرار گرفته‌است و حدودا bp6407 نیز طول دارد. فاژهای رشته‌ای چرخه زندگی لیتیک ندارند و باعث لیز شدن سلول میزبان نمی‌شوند، اما در عین حال چرخه لیزوژنیک آنها به شکلی است که سلول میزبان بدون این‌که لیز شود فاژهای رشته‌ای را تولید کرده و به خارج از سلول ترشح می‌کند(7).

1-4-2 ساختار باکتریوفاژ M13

از فاژهای بدون دم تنها حدود 10 خانواده شناسایی شده‌اند که بر اساس شکل ظاهری به انواع فاژهای رشته‌ای[20]، کروی[21]، لیمویی شکل[22] و یا پلی‌مورفیک[23] تقسیم‌بندی می‌شوند که به طور کلی دارای پوشش لیپیدی می‌باشند و ژنوم آنها نیز به شکل DNA و RNA تک‌رشته‌ای یا دورشته‌ای به صورت قطعه قطعه شده و یا ساده می‌باشد. فاژ M13 نیز جزء فاژهای رشته‌ای طبقه‌بندی می‌شود و ژنوم آن شامل DNA تک‌رشته‌ای حلقوی است (24). ذره نوکلئوپروتئینی فاژ M13 حدود (nm900) طول و نیز (nm5/6) قطر دارد.ژنوم فاژ توسط یک پوشش پروتئینی متشکل از 5 نوع پروتئین مختلف پوشیده شده است و به طور عمده شامل پروتئین PVIII می‌باشد. در دو انتها توسط 4 نوع پروتئین‌ پوششی کوچک (minor) پوشیده می‌شود که 5 کپی از هر پروتئین در ساختار کپسید مشاهده می‌شود. در یک انتهای فاژ که باعث وارد شدن ژنوم فاژ به درون سلول میزبان می‌شود، یک سیگنال بسته‌بندی[24] وجود دارد که شامل یک ساختار دورشته‌ای ناقص (hairpin loop) است که توسط 5 نسخه از هر یک از پروتئین‌های gp7 و gp9 پوشیده می‌شود. البته این دو پروتئین برای شروع فرآیند بسته‌بندی فاژ نیز ضروری هستند. در انتهای دیگر فاژ 5 نسخه از هر یک از پروتئین‌های gp3 و gp6 وجود دارد که برای خاتمه صحیح فرآیند بسته‌بندی فاژ ضروری هستند. پروتئین gP3 بزرگترین و پیچیده‌ترین پروتئین موجود در ساختار فاژ می‌باشد و در عفونت‌زایی و شناسایی سلول میزبان نقش بسیار اساسی دارد. هم‌چنین gp3 یک دومین فعال دارد که به جذب اختصاصی به داخل سلول میزبان و نیز نفوذ ژنوم در مرحله بعد از عفونت‌زایی کمک می‌کند. یک فاژ زنده و پایا حدود 2700 کپی از پروتئین gp8 را دارد که یک پروتئین با حدود 50 اسیدآمینه می‌باشد و به عنوان پروتئین عمده(major) کپسید محسوب می‌شود. پروتئین پوششی major، یک ساختار مارپیچی در اطراف ژنوم تشکیل می‌دهد. هر gp8 یک پایانه آمینی دوگانه‌دوست دارد که خارج از ساختار پوشش فاژ است و یک پایانه کربوکسیلی دارد که در پوشش فاژ با DNA برهمکنش دارد و البته در مرکز ساختار پروتئینی gp8 نیز یک دومین آبگریز وجود دارد که باعث ارتباط یک پروتئین پوششی با پروتئین پوششی مجاورش می‌شود.به نظر می‌‌رسد که هر یک از پروتئین‌های پوششی از طریق ارتباط آبگریزی که با ژنوم ویروس دارد، باعث پایداری ساختار ویروس می‌شوند و عامل اولیه حفظ ساختار محکم و منظم فاژ محسوب می‌گردند(53-58_ENREF_53).

شکل 1-4 ساختاری فرضی از باکتریوفاژ M13(54)

1-4-3 سازماندهی ژنومی باکتریوفاژ M13

در رابطه با فاژ M13 باید گفت که دو فرم از DNA فاژ وجود دارد. یک فرم همان مدل DNA تک‌رشته‌ای (ssDNA) است که به راحتی از محیط کشت قابل جداسازی است و برای توالی‌یابی نیز کاربرد گسترده‌ای دارد. فرم دوم مدلDNA دورشته‌ای (dsDNA) می‌باشد. از آنجایی که این مدل تنها در سلول باکتری میزبان یافت می‌شود به همین علت از محیط کشت باکتری آلوده شده به فاژ به راحتی قابل جداسازی است و برای کلونینگ یک قطعه ژنی مورد استفاده قرار می‌گیرد. سازماندهی ژنتیکی فاژ M13 و فاژهای نزدیک به آن به این شکل است که 9 قالب خواندنی باز[25] و نیز دو توالی بین ژنی در توالی کامل DNA مربوط به این فاژها مشاهده می‌شود و هم‌چنین لازم به ذکر است که ژن‌های X و XI به طور کامل و به ترتیب در ژن های II و I قرار گرفته‌اند. پروتئین‌های کد شده توسط فاژ به سه گروه فعال تقسیم می‌شوند که شامل:

1. gp2- gp5- gp10: در همانند سازی DNA و ریخت‌زایی نقش دارند.

2. gp1- gp4- gp11: در تجمع فاژها و ترشح آنها نقش دارند.

3. gp3- gp6- gp7- gp8- gp9: کد کننده پروتئین‌های minor و major می‌باشند.

نواحی بین ژنی که بین ژن‌های II و IV وجود دارند پروتئینی را کد نمی‌کنند ولیکن شامل سیگنال‌هایی هستند که برای شروع سنتز DNA فاژ وهم‌چنین سنتز رشته مکمل DNA فاژ لازم هستند. البته در تجمع فاژها، خاتمه سنتز RNA، بیان ژن‌های IX-X-II-V-VII-VIII نقش حیاتی و مهمی را ایفا می‌کنند و نیز به عنوان منطقه‌ای برای ورود ژن خارجی به درون وکتور نیز در نظر گرفته می‌شوند. یک ناحیه بین ژنی کوچک‌تر که بین ژن‌های III و VIII وجود دارد شامل یک سیگنال خاتمه رونویسی و نیز یک پروموتر برای بیان ژن‌های III- VI- I- XI- IV دارد(24, 59).

1-4-4 چرخه زندگی باکتریوفاژ M13

همان‌طور که ذکر شد باکتریوفاژ M13 دارای چرخه زندگی لیزوژنیک می‌باشد و عفونت‌زایی فاژ هنگامی آغاز می‌شود که از طریق پروتئین پوششی gp3 به پیلی باکتری E-coli متصل می‌شود. این پروتئین با ایجاد منافذی در غشاء سلول میزبان ورود ژنوم ویروس به درون سلول میزبان راتسهیل می‌کند. بعضی پروتئین‌هایی که توسط سلول باکتری میزبان کد می‌شوند و در غشاء خارجی قرار دارند همچون؛ TolA
TolR-TolQ نیز در برداشتن پوشش فاژ و نفوذ DNA به درون سلول نقش دارند و احتمالاً در نواحی adhesion بین غشاء داخلی و خارجی عمل می‌کنند. در حین ورود فاژ به درون سلول میزبان، gp6 که آبگریز است و باعث پایداری فاژ نیز می‌شود جدا شده و فاژ حاصل disassemble و سایر پروتئین‌های minor و major نیز از فاژ جدا می‌شوند و در مجاورت غشاء داخلی تجمع پیدا می‌کنند. با تزریق ژنوم فاژ به درون سیتوپلاسم و ورود DNA تک‌رشته‌ای حلقوی به سلول میزبان، توسط ماشین همانندسازی سلول میزبان به فرم دورشته‌ای همانندساز(RF)[26] تبدیل می‌شود. فرم RF با سیستم حلقه غلتان[27]، DNA تک‌رشته‌ای حلقوی را تولید می‌کند و هم‌چنین مورد رونویسی قرار گرفته تا پروتئین‌های پوششی را سنتز نماید. پیش از بسته‌بندی ژنوم فاژ، پروتئین gp5 به ساختار تک‌رشته‌ای ژنوم فاژ متصل شده و مانع از تجزیه آن می‌شود. سایر پروتئین‌های فاژی نیز در غشاء داخلی باکتری قرار گرفته و یک کمپلکس منفذی را تشکیل می‌دهند که غشاء داخلی و خارجی را به یکدیگر متصل می‌کند و سپس طی یک پروسه‌ای که تا کنون مکانیسم دقیق آن مشخص نشده است، DNA حلقوی فاژ از داخل این کمپلکس عبور کرده و در همین حین پروتئین‌های پوششی فاژ به آن متصل می‌شود. در ابتدا پروتئین‌های gp7 و gp9 به DNA فاژ متصل شده و سپس فرآیند بسته‌بندی ذرات فاژی با اتصال پروتئین gp8 ادامه پیدا کرده و در نهایت پروتئین‌های gP6 و gp3 متصل شده و زاده‌های فاژی حاصل از طریق غشاء باکتری به خارج از سلول باکتری ترشح می‌شوند(54).

1-4-5 فاژ M13 به عنوان ناقل ژنی

فاژ M13 حدودmµ 1 طول و کمتر از nm10 قطر دارد. سایز کوچک و ساختار رشته‌ای این ذره فاژی به عنوان یکی از مهم‌ترین ویژگی‌های این فاژ محسوب می‌شود و در نتیجه توانایی عبور از بسیاری از بافت‌ها و حتی عبور از سد خونی- مغزی و وارد شدن به سیستم عصبی مرکزی را خواهد داشت. در سال 1970 دانشمندان دو فرم فضایی از ساختار ژنوم M13 را شناسایی کردند که در شرایط متفاوت سرعت رسوب متفاوتی را نشان می‌دادند و هم‌چنین پس از بررسی‌هایی که با میکروسکوپ الکترونی انجام دادند متوجه شدند که این دو فرم متفاوت ژنوم فاژی، ساختار فضایی متفاوتی نیز دارند که بیان کننده انعطاف‌پذیری بسیار بالای ژنوم فاژ M13 می‌باشد و این ناقل ژنی را به عنوان یک ابزار انتقالی جذاب و کارآمد معرفی می‌کند. تحویل‌دهنده‌های فاژمیدی جزء تحویل‌دهنده‌هایی هستند که در زمینه‌های مختلف بیوتکنولوژی و به خصوص در زمینه فاژنمایی و انتقال ژن کاربرد زیادی دارند(2, 61, 62).

از دلایل انتخاب فاژمیدها به عنوان ناقل‌های ژنی می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

1. ژنوم فاژمید نسبت به سایر تحویل‌دهنده‌های ژنی کوچک‌تر است و در نتیجه قابلیت پذیرش اندازه بیشتری از ترانسژن را دارد. با توجه به انعطاف پذیری بالای فاژ M13، بر خلاف تحویل‌دهنده‌های ژنی فاژ لامبدا، امکان افزایش طول ژنوم و در نتیجه تغییر ساختار فاژی وجود دارد. با در نظر گرفتن این موضوع هدفمندسازی فاژ و هم‌چنین انتقال ترانسژن به طور همزمان انجام خواهد شد و بدین ترتیب در طراحی ناقل‌های فاژی مبتنی بر فاژ M13 با مشکل محدودیت اندازه ژنوم و بسته‌بندی فاژ روبرو نخواهیم شد(8, 13).

2. فاژمیدها در فرآیند ترانسفورماسیون به شکل کارآمدتری عمل می‌کنند که این ویژگی منجر به تشکیل کتابخانه‌های فاژمیدی با تنوع بالاتری می‌شود.

3. میزان بیان پروتئین‌های نوترکیب به راحتی قابل کنترل می‌باشد.

4. فاژمیدها نسبت به سایر ناقل‌های ژنی به خصوص نسبت به فاژهای نوترکیب پس از چند دوره تکثیر میزان پایداری بیشتری را از خود نشان می‌دهند(63).

موفقیت انتقال ژن به هسته توسط ناقل‌های ژنی مبتنی بر فاژهای رشته‌ای همچون سایر ناقل‌های ژنی ویروسی به سه مورد؛ 1. برداشت سلولی مؤثر توسط سلول هدف 2. فرار اندوزومی و 3. ورود مؤثر به هسته سلول احتیاج دارد. البته در مورد فاژهای رشته‌ای نکته دیگری که باید در نظر گرفت این است که این دسته از حامل‌های ژنی برای این‌که توسط ماشین رونویسی سلول بهتر مورد شناسایی قرار بگیرند باید به فرم دورشته‌ای تبدیل شوند(64). در سال 1999 محققان با ارائه قطعات آنتی‌بادی بر علیه گیرنده سطح سلولی ErbB2 در سطح ذرات فاژی M13 به صورت ادغام با پروتئین gp3، موفق به ورود این حامل‌های ژنی به درون سلول‌های سرطانی سینه شدند و شاهد بیان ژن GFP در این سلول‌ها بودند. این یافته به عنوان اولین موفقیت انتقال ژن توسط فاژهای رشته‌ای به سلول‌های پستانداران گزارش شد(65). پیش از این، یک مورد دیگر انتقال ژن توسط فاژ M13 نیز گزارش شده بود که هدفمندسازی فاژی از طریق مولکول‌های آداپتور بیوتین و استرپتاویدین انجام شده بود(66). در حالی‌که اتصال لیگاند اختصاصی گیرنده موجود بر سطح سلول هدف از طریق تکنیک فاژنمایی روش مناسب‌تر و کارآمدتری جهت هدفمندکردن انتقال ژن به کمک ویروس‌های پروکاریوتی به نظر می‌رسد. بر اساس مشاهدات انجام شده کارآیی انتقال ژنوم فاژمید با تیمار ترکیبات سمی مثل ترکیبات genotoxic افزایش می‌یابد. تیمار با ترکیبات genotoxic شامل شوک حرارتی، تابش اشعه UV، مهارکننده توپوایزومرازI در سطح بالین کاربردی نمی‌باشند ولیکن این نکته از این نظر حائز اهیمت می‌باشد که این ترکیبات سبب فعال شدن پروتئین‌هایی می‌شوند که در ترمیم DNA نقش دارند و سبب تبدیل ژنوم تک‌رشته‌ای فاژمید به فرم دورشته‌ای (RF) می‌شوند.القاء ترکیبات genotoxic در رده سلولی سرطان ریه انسانی(H1299) سبب افزایش بیان ژن EGF منتقل شده توسط ناقل‌های فاژمیدی تا سطح 45 درصد شده است. این موضوع مؤید این مطلب است که تبدیل فرم تک‌رشته‌ای ژنوم M13 به فرم دورشته‌ای می‌تواند در افزایش بیان ترانسژن نقش بسزایی داشته باشد(67). به این ترتیب یکی از تمهیداتی که در راستای افزایش کارآیی انتقال ژن در سلول‌های پستانداران(2) شده است، طراحی ناقل‌های ژنی با توالی‌های پالیندروم بوده است، به این ترتیب که تمام توالی بیانی داخل ناقل ژنی و یا بخشی از آن به صورت پالیندروم طراحی می‌شود و بر اساس گزارشات منتشر شده زمانی که تمام توالی بیانی به صورت پالیندروم طراحی شود بیشترین افزایش بیان ترانسژن را خواهیم داشت(68). بر اساس نتایج مشاهده شده دانشمندان پیشنهاد کردند که تبدیل DNA تک‌رشته‌ای مربوط به فاژمید به صورت DNA دورشته‌ای در سلول‌های پستانداران با کارآیی پایینی انجام می‌شود در حالیکه توالی DNA دورشته‌ای به شکل بهتری توسط ماشین رونویسی سلول میزبان مورد شناسایی قرار می‌گیرد و در نتیجه شاهد افزایش بیان ترانسژن خواهیم بود.

در ارتباط با فاژ M13 نیز نشان داده شده است که مشابه با ناقل‌های فاژی مبتنی بر لامبدا، موفقیت برداشت فاژ توسط سلول هدف بسیار بیشتر از انتقال ژن می‌باشد؛ حدود 100 درصد از سلول‌هایی که گیرنده اختصاصی لیگاند ارائه شده در سطح فاژ را دارا می‌باشند، فاژ را دریافت می‌کنند در حالیکه کمتر از 10 درصد از این سلول‌ها بیان ترانسژن را نشان می‌دهند. جای تعجب ندارد که فاژها به علت این ‌که توالی‌های مربوط به فرار اندوزومی ویروس‌ها را ندارند، پس از ورود به سلول وارد اندوزوم و بعد لیزوزوم شده و تنها تعداد کمی از آنها موفق به فرار از اندوزوم و انتقال ژن به هسته سلول می‌شوند. البته با تغییر ژنتیکی ژنوم فاژ امکان بهبود فرآیند انتقال ژن وجود دارد به عنوان مثال با واردکردن توالی‌های مربوط به فرار اندوزومی، ورود به هسته و همانندسازی ویروس‌های یوکاریوتی در ژنوم فاژ روند انتقال و بیان ژن توسط این دسته از تحویل‌دهنده‌های ژنی تا حد زیادی بهبود پیدا خواهد کرد(2).

همانگونه که ذکر شد، ابعاد فاژ M13 به عنوان یکی از شاخصه‌های برجسته این فاژ محسوب می‌شود و با این وجود قابلیت بهتری در عبور از عروق خونی خواهد داشت که در تجویز وریدی، دهانی و تنفسی بسیار حائز اهمیت می‌باشد. شایان توجه است که محققان نوعی حامل فاژمیدی را طراحی کردند که با آنتی‌بادی‌های شناسایی کننده پلاک‌های آمیلوئیدی هدفمند شده است. پس از تجویز تعداد 10¹¹ذره فاژی از مسیر تنفسی نه تنها آسیبی به سلول‌های مغزی نرسیده است بلکه شناسایی و عکسبرداری از پلاک‌های آمیلوئیدی سلول‌های مغزی موش با کارآیی بالایی انجام شد. موفقیت عملکرد ذرات فاژی در این پروژه تحقیقاتی نه تنها نویدبخش کاربرد تحویل‌دهنده‌های ژنی فاژی در ژن‌‌درمانی سلول‌های مغزی می‌باشد بلکه سبب تحولی عظیم در زمینه تشخیص بیماری‌های مغزی به خصوص در مراحل اولیه بیماری خواهد شد(69)

1-5 اهمیت و اهداف پژوهش

ژن‌درمانی یکی از پرآوازه‌ترین کاربردهای دانش پزشکی در زمینه درمان بیماری‌های وراثتی و حتی اکتسابی می‌باشد و محققان در تلاش هستند تا این روش درمانی را به عنوان یک روش جایگزین روش‌های مرسوم درمان بیماری‌های ژنتیکی معرفی کنند. با این وجود موانع زیادی در مسیر فراگیر شدن این روش درمانی وجود دارد که شامل طراحی یک ابزار انتقال ژن با حداقل عوارض جانبی و نیز حداکثر کارآیی انتقال و بیان ژن می‌باشد. همان‌گونه که در بخش‌های قبلی بحث شد تحویل‌دهنده‌های ویروسی و غیرویروسی رایج، هر یک مشکلاتی دارند که کاربرد آنها را در سطح کلینیکی محدود کرده است. بدین ترتیب فاژها با توجه به ویژگی‌هایی که دارند نه تنها به عنوان یک ناقل ژنی بلکه به عنوان یک ابزار انتقالی برای تجویز هدفمند دارو و واکسن نیز در عرصه پزشکی انقلابی عظیم ایجاد کرده‌اند و ناقلین بسیاری مبتنی بر فاژها طراحی و مورد استفاده قرار گرفته‌اند. نشان داده شده است که کارآیی ورود و انتقال ژن توسط ذرات فاژی به سلول‌های پستانداران به فاکتورهای متعددی بستگی دارد. به نظر می‌رسد که علاوه بر حضور مولکول‌های هدفگیری بر سطح ذرات فاژی، ساختار ژنومی ناقل فاژی نیز در انتقال مؤثر ترانسژن نقش بسزایی داشته باشد. دو ناقل ژنی که در پژوهش‌های بسیاری در سرتاسر دنیا مورد استفاده قرار گرفته اند، تحویل‌دهنده‌های ژنی مبتنی بر لامبدا و M13 می‌باشند. انتظار می‌رود که این دو نوع ناقل فاژی از لحاظ ساختار ژنومی متفاوتی که دارند، عملکرد متفاوتی نیز در تحویل و بیان ترانسژن در سلول هدف داشته باشند. از آنجا که در مورد کاربرد هم‌زمان و مقایسه کارآیی آنها گزارشی ارائه نشده است و در تمام پژوهش‌ها تنها یکی از این ناقل‌های مهم مورد توجه بوده است. بنابراین پژوهش حاضر با هدف مقایسه کارآیی و تأثیر احتمالی ساختار ژنوم آنها در انتقال و بیان ژن انجام گرفت.

اهداف جزئی این تحقیق شامل:

- ارزیابی بیان و کارآیی انتقال ژن توسط ذرات فاژی M13-GFP

- مقایسه کارآیی انتقالو بیان ژن درناقل‌های ژنی pCMV Script GFPوλ-ZAP-CMV-GFP القاء شده با روش لیپوفکشن

- شناسایی ناقل فاژی کارآمد با بیشترین قابلیت انتقال و بیان ترانسژن

[1]Adeno Associated Virus

[2] Freeze-thaw

[3] Phage display

[4]Chemical coupling

[5] Folding

[6] Tailed phages

[7] Herpes Virus

[8] Caudovirales

[9] Siphoviridae

[10] Myoviridae

[11]Podoviridae

[12]Temperate phages

[13] Virulent phages

[14]Immediate-Early stage

[15]Delayed-early stage

[16]Late stage

[17]Folding

[18]In vivo

[19]In vitro

[20]Rod shape

[21] Spherical shape

[22] Lemon shape

[23] Pleoomorphic shape

[24]Packaging Signal

[25]Open Reading Frame

[26]Replicative Form

[27] Rplling circle

دریافت فایل

مقایسه و ارزیابی کارآیی انتقال و بیان ژن GFP به سلول‌های یوکاریوتی توسط سازه‌های فاژی لامبدا و M13

یاهو مارکت دوشنبه 20 آذر 1396 ساعت 17:59

0 نظر

پلان مجتمع مسکونی

پروژه کامل مجتمع مسکونی (پایان نامه یا طرح نهایی)

با پلان های کامل

4 رندر با کیفیت

برای خرید این پروژه بر روی گزینه توضیحات بیشتر / دانلود کلیک کنید سپس شماره موبایل و ایمیل خود را وارد کنید مستقیم به درگاه بانک هدایت میشوید پس از واریز مبلغ پروژه لینک دانلود برای شما نمایش داده میشود و یک ایمیل حاوی لینک دانلود نیز یه ایمیلتان ارسال می شود.

دریافت فایل

پلان مجتمع مسکونی

یاهو مارکت دوشنبه 20 آذر 1396 ساعت 17:58

0 نظر

مطالعه ی ساختار، فعالیت چاپرونی و آلرژی زایی کازئین بتای قندی و غیرقندی...

چکیده

کازئینها فسفوپروتئینهایی هستند که 80 درصد پروتئینهای شیرگاو را تشکیل میدهند. این پروتئینها شامل انواع مختلف نظیرαS1 ، αS2، β و κ میباشند. اگرچه آلرژیزایی این پروتئینها امروزه یکی از چالش های بزرگ علم پزشکی است، اما آنها به عنوان منبع غنی پپتیدهای فعال زیستی با فعالیتهای مختلف از جمله خاصیت آنتیاکسیدانی و فعالیت ضد فشار خون میباشند. در این پژوهش کازئینبتا با استفاده از ستون کروماتوگرافی تعویض یونی دی اتیل دی آمینواتیل-سلولز خالص شد. سپس کل کازئینهای شیرگاو و کازئین بتا به روش غیرآنزیمی و در شرایط احیایی قندی شد. نتایج آزمون جذبی اُ-فتالدئید و نشری فلورسامین حاکی از درصد بالای قندی شدن این پروتئینها در روش احیایی بود. مطالعهی ساختاری کازئینبتا با استفاده از دستگاه فلورسانس و دستگاه دورنگنمایی دورانی بیانگر تغییرات قابل توجه ساختار این پروتئین ضمن فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی بود. از منظر فعالیت چاپرونی دو کازئینبتای قندی و غیرقندی تفاوت قابل ملاحظهای را نشان دادند. در این مطالعه پس از هضم ناقص این پروتئینها با دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین، خواص آنتی اکسیدانی، توانایی مهار آنزیم ACE و فعالیت آلرژیزایی آنها و پپتیدهای حاصل از هضمشان بررسی شد. نتایج این پژوهش پیشنهاد میکند که در تمام موارد هم با قندی شدن هم طی هضم ناقص کازئینها فعالیت آنتیاکسیدانی این پروتئینها تا حدودی بهبود مییابد. نتایج این پژوهش پیشنهاد میکند که خاصیت آلرژیزایی کازئینبتا بعد از قندی شدن و هضم آنزیمی با آنزیمهای فوقالذکر به طور معنا داری تغییر نمی کند. همچنین نتایج این پژوهش نشان داد که فعالیت آلرژیزایی تنها کازئینهای شیرگاو که با قند لاکتوز قندی شده بودند ضمن هضم ناقص با آنزیم کیموتریپسین کاهش مییابد. همچنین مطالعهی فعالیت مهاری آنزیم ACE پیشنهاد میکند که کازئینبتای غیرقندی و محصولات پپتیدی حاصل از هضم آنزیمی ناقص آن نسبت به پروتئینهای قندی و محصولات هضم ناقص آنزیمی آنها خاصیت مهار آنزیم ACE بیشتری را دارد. در مجموع به منظور دستیابی محصولات هضمی کازئینی با توان آلرژیزایی کمتر و خواص زیستی ارتقا یافته به مطالعات بیشتری همراه با تغییر شرایط آزمایشگاهی نظیر تغییر زمان هضم و یا تغییر نسبت پروتئاز به سوبسترای کازئینی ضروری به نظر میآید.

واژگان کلیدی:ساختار کازئینبتا، فعالیت چاپرونی، فعالیت مهار آنزیم ACE، فعالیت آنتیاکسیدانی، آلرژیزای.

فهرست مطالب

عنوان صفحه

فصل اول: مقدمه

1-1- شیر2

1-2- ترکیبات شیر4

1-3- پروتئینهای شیر5

1-3-1- پروتئینهای آب پنیر6

1-3-2- کازئینها7

1-3-3- کازئینبتا9

1-4- فعالیتهای زیستی کازئینها11

1-4-1- فعالیت چاپرون کازئینهای شیر11

1-4-2- پپتیدهای فعال زیستی12

1-4-2-1- پپتیدهای فعال زیستی12

1-4-2-2- منابع اصلی پپتیدهای فعال زیستی12

1-4-2-3- برخی از خواص پپتیدهای فعال زیستی12

1-4-2-3-1- خاصیت ضد فشار خون12

1-4-2-3-2- فعالیت آنتیاکسیدانی14

1-5- مشکلات ناشی از مصرف شیر در افراد15

1-5-1- عدم تحمل لاکتوز15

1-5-2- آلرژی به پروتئینهای شیر16

عنوان صفحه

1-5-2-1- معرفی انواع آزمونهای رایج جهت مطالعهی فرآیند آلرژی18

1-5-2-2- آزمون الایزا19

1-6- قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها20

فصل دوم: مروری بر پژوهشهای پیشین.............. 23

فصل سوم: مواد و روشهای تحقیق

3-1- مواد مصرفی............................. 27

3-2- تهیهی محلولها.......................... 28

3-2-1- تهیهی محلولهای کازئینی، کازئینبتا و تعیین غلظت آنها........................................... 28

3-2-2- تهیهی محلول برادفورد و رسم نمودار استاندارد آن با

استفاده از کازئینبتا...................... 28

3-2-3- تهیهی محلولهای مورد نیاز برای الکتروفورز ژلی 30

3-2-3-1-تهیه محلول SDS 20 درصد........... 30

3-2-3-2- تهیه محلول آمونیوم پر سولفات (APS)30

3-2-3-3- تهیه محلول آکریلامید و بیس آکریلامید 31

3-2-3-4- تهیه بافر تریس 5/1 مولار......... 31

3-2-3-5- تهیه بافر تریس 5/0 مولار......... 31

3-2-3-6- تهیه بافر تانک به حجم 500 میلیلیتر 31

3-2-3-7- تهیه بافر نمونه X2.............. 32

3-2-3-8- تهیه 100 میلیلیتر محلول کوماسیبلو33

3-2-3-9- تهیه محلول رنگ بر ژل............ 33

3-2-4- تهیه محلول OPA به حجم 50 میلیلیتر... 33

3-2-5- تهیه محلول فلورسامین................ 34

عنوان صفحه

3-2-6- تهیه محلول ANS...................... 35

3-2-7- تهیه محلول ABTS رادیکال............ 36

3-2-8- تهیه عصارهی ACE از پودر استون شش خرگوش 37

3-3-روشها................................... 38

3-3-1- تخلیص کازئینبتا شیرگاو.............. 38

3-3-2- تخلیص هموگلوبین A از خون انسان...... 39

3-3-3- تعیین میزان خلوص پروتئین با استفاده از SDS-PAGE40

3-3-4- تهیه پودر استون شش خرگوش............ 40

3-3-5- قندی کردن کازئینبتا و کازئینهای شیرگاو به روش غیرآنزیمی........................................... 41

3-3-6- آزمونهای OPA و فلورسامین برای تایید فرآیند

قندی شدن غیرآنزیمی......................... 41

3-3-7- مطالعهی فلورسانس ذاتی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی........................................... 42

3-3-8- مطالعهی فلورسانس عارضی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی........................................... 43

3-3-9- مطالعه تغییرات ساختاری کازئینهای بتای قندی و غیرقندی،

با استفاده از دستگاه دورنگ نمایی دورانی.... 43

3-3-10- مطالعهی فعالیت چاپرونی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی........................................... 44

3-3-11- هضم کازئینهای شیرگاو و کازئینبتای قندی و غیرقندی

به وسیلهی آنزیمهای تریپسین و کیموتریپسین پانکراس گاوی44

3-3-12- مطالعهی فعالیت آنتیاکسیدانی کازئینهای شیرگاو کازئینبتای

قندی و غیرقندی............................ 45

3-3-13- مطالعهی فعالیت مهار آنزیم ACE به وسیلهی کازئینبتا

قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آنها 47

3-3-14- مطالعهی توان آلرژیزایی کازئینها و کازئینبتای قندی

و غیرقندی................................. 47

عنوان صفحه

3-3-15- آزمون آماری........................ 48

فصل چهارم: نتایج و بحث

4-1- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیتهای زیستی

(چاپرونی، آنتیاکسیدانی و مهار آنزیمACE ) و آلرژیزایی کازئینبتا............................................ 50

4-1-1- تخلیص پروتئین کازئینبتا............. 50

4-1-2- تخلیص هموگلوبینA از خون انسان....... 51

4-1-3- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئینبتا

در حضور مادهی احیا کننده................... 52

4-1-3-1- مطالعهی قندی شدن کازئینبتا با استفاده از ترکیب OPA......................................... 53

4-1-3-2- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئینبتا با استفاده

از ترکیب فلورسامین...................... 54

4-1-3-3- استفاده از ژل SDS-PAGE احیایی برای تایید فرآیند

قندی شدن غیرآنزیمی کازئینبتا............. 55

4-1-4- مطالعهی فلورسانس ذاتی و عارضی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی.................................... 56

4-1-5- مطالعه ساختار دوم کازئینهای بتای قندی و غیرقندی با استفاده

از دستگاه دورنگ نمایی دورانی............... 58

4-1-6- مطالعه فعالیت چاپرونی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی........................................... 60

4-1-7- هضم آنزیمی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی با آنزیمهای

تریپسین و کیموتریپسین..................... 62

4-1-7-1- تایید فرآیند هضم آنزیمی با استفاده از ژلSDS-PAGE

(15درصد) احیایی.......................... 63

عنوان صفحه

4-1-7-2- مطالعه فعالیت آنتیاکسیدان کازئینهای بتای قندی

و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنها... 65

4-1-7-3- مطالعه خاصیت مهار آنزیم ACE به وسیلهی کازئینهای

بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آنها 71

4-1-8- مطالعه آلرژیزایی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای

حاصل از هضم آنزیمی آنها.................... 73

4-2- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیت آنتیاکسیدانی

و آلرژیزایی کازئینهای شیرگاو............... 77

4-2-1- جداسازی و قندی کردن کازئین شیرگاو... 77

4-2-2- تایید فرآیند قندی شدن کازئینهای شیرگاو 77

4-2-2-1- استفاده از ژل SDS-PAGE (12 درصد) برای تایید

قندی شدن غیرآنزیمی...................... 77

4-2-2-2- استفاده از ترکیب OPA برای مطالعهی قندی شدن غیرآنزیمی

کازئینهای شیرگاو......................... 78

4-2-3- هضم آنزیمی کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو با آنزیمهای

تریپسین و کیموتریپسین..................... 80

4-2-4- مطالعه فعالیت آنتیاکسیدان کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو

و پپتیدهای حاصل از هضم آنها............... 82

4-2-5- مطالعه آلرژیزایی کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو و پپتیدهای

حاصل از هضم آنزیمی آنها به وسیلهی دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین................................ 86

عنوان صفحه

خلاصه ی نتایج .................................. 90

نتیجهگیری نهایی.............................. 91

فهرست منابع و مآخذ............................ 92

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول1-1- ترکیبات سازنده شیر در جانوران مختلف بر حسب درصد4

جدول1-2- برخی ویژگیهای پروتئینهای آب پنیر شیرگاو6

جدول1-3- برخی از ویژگیهای کازئینهای شیرگاو..... 7

جدول3-1- رسم منحنی استاندار برادفورد با استفاده از کازئینبتا

(1 میلی گرم بر میلی لیتر) به عنوان پروتئین استاندارد29

جدول 3-2- مواد و مقادیر مورد نیاز برای تهیه 500 میلی لیتر بافر تانک.......................................... 32

جدول3-3- مواد و مقادیر مورد نیاز برای تهیه 25 میلی لیتر بافر نمونه X2............................................ 32

جدول4-1-1- محتوی ساختارهای دوم نمونههای کازئینبتای قندی و غیرقندیبر حسب درصد59

فهرست اشکال

عنوان صفحه

شکل1-1-نمایی از ترکیبات موجود در شیر........... 3

شکل1-2- پروتئینهای تشکیل دهنده شیرگاو.......... 5

شکل1-3- نمایی از چگونهگی تشکیل میسل کازئین شیر. 8

شکل 1-4- جهش جایگزینی پرولین67 وتبدیل آن به هیستیدیندر کازئینبتا A1............................................. 9

شکل1-5- نمایی از سیستم رنین- آنژیوتنسین به عنوان سیستم

مهم تنظیم کننده فشار خون...................... 13

شکل1-6-نمایی از انواع اپیتوپهای خطی و فضایی پروتئینی17

شکل1-7- علائم حساسیت به شیرگاو................. 17

شکل1-8- آزمون خراش پوستی برای تعیین میزان حساسیت فرد به مادهی آلرژیزا....................................... 19

شکل 3-1- نمونهایی از نمودار استاندار برادفورد. 30

شکل 3-2- نمایی از ساختارشیمیایی ترکیب OPA..... 34

شکل 3-3- نمایی ازساختار شیمیایی فلورسامین..... 35

شکل 3-4- نمایی از ساختار شیمیایی ترکیب ANS.... 36

شکل 3-5- تولید ABTS رادیکال در حضور پتاسیم پرسولفات 37

شکل 3-6- نمونهایی از نمودار استاندارد ترولوکس. 46

شکل4-1-1- نمایی از SDS-PAGE احیایی (12درصد) مراحل خالصسازی پروتئین

کازئینبتا..................................... 51

عنوان صفحه

شکل4-1-2- نمایی از SDS-PAGE احیایی (12درصد) فرآیند خالصسازی

پروتئین هموگلوبین A انسانی.................... 52

شکل4-1-3- نتایج مطالعهی قندی شدن غیرآنزیمی پروتئین کازئینبتا

با استفاده از آزمون OPA....................... 53

شکل4-1-4- نتایج حاصل از قندی شدن غیرآنزیمی کازئینبتا با استفاده

از آزمون فلورسامین............................ 54

شکل4-1-5- نمای از SDS-PAGE احیایی (12درصد) که به منظور تایید

قندی شدن پروتئین در این مطالعه استفاده شد.... 55

شکل 4-1-6- طیف نشری فلورسانس ذاتی کازئینبتای قندی و غیرقندی 56

شکل4-1-7- نمایی از نشر فلورسانس عارضی کازئینهای بتا ی قندی و غیرقندی

که با استفاده از نشانگر فلورسانس ANS بررسی شد57

شکل4-1-8- طیف دور فرابنفش (Far-Uv CD) کازئینبتای قندی و غیرقندی59

شکل4-1-9- مطالعهی فعالیت چاپرونی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی

با استفاده از هورمون انسولین به عنوان پروتئین هدف 61

شکل4-1-10- مطالعهی فعالیت چاپرونی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی

با استفاده از هموگلوبین به عنوان پروتئین هدف. 62

شکل4-1-11- نمایی از SDS-PAGE احیایی (15درصد) هضم کازئینهای بتای

قندی و غیرقندی با آنزیم تریپسن............... 63

شکل4-1-12- نمایی از SDS-PAGE احیایی (15درصد) هضم کازئینهای بتای

قندیو غیرقندی با آنزیم کیموتریپسن............. 64

شکل4-1-13- مطالعه خاصیت آنتیاکسیدان کازئینبتای قندی و غیرقندی

و پپتیدهای حاصل از هضم این پروتئین به وسیلهی آنزیم تریپسین 66

عنوان صفحه

شکل4-1-14- این شکل بیانگر ظرفیت آنتیاکسیدانی معادل ترلوکس (TEAC)

کازئینبتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم 2 و 4 ساعتهی آنها

با آنزیم تریپسین میباشد...................... 67

شکل4-1-15- مطالعه خاصیت آنتیاکسیدان کازئینبتای قندی و غیرقندی

و پپتیدهای حاصل از هضم این پروتئین به وسیلهی آنزیم کیموتریپسین.............................................. 69

شکل4-1-16- این شکل بیانگر ظرفیت آنتیاکسیدانی معادل ترلوکس (TEAC)

کازئینبتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم 2 و 4 ساعتهی آنها

با آنزیم کیموتریپسین میباشد................... 70

شکل4-1-17- نتایج آزمون مهار آنزیم ACE به وسیلهی کازئینهای بتای

قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنها به وسیلهی

دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین................ 71

شکل4-1-18- نتایج بررسی میزان آلرژیزایی کازئینبتای قندی و غیرقندی

و پپتیدهای حاصل از هضم 4 ساعتهی آنها به وسیلهی دو آنزیم تریپسین

و کیموتریپسین................................ 74

شکل4-1-19- مقایسهی میزان آلرژیزایی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی

با پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آنها با دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین................................... 75

شکل4-2-1- نمای از SDS-PAGE احیایی (12درصد) که به منظور تایید

قندی شدن غیرآنزیمی پروتئین در این مطالعه استفاده شد78

شکل4-2-2- نتایج مطالعهی قندی شدن غیرآنزیمی پروتئین کازئینبتا با استفاده

از آزمون OPA.................................. 79

شکل4-2-3- ژل SDS-PAGE احیایی (15درصد) هضم کازئینهای قندی

و غیرقندی شیرگاو به وسیلهی آنزیم تریپسین..... 80

عنوان صفحه

شکل4-2-4- نمایی از SDS-PAGE احیایی (15درصد) هضم کازئینهای قندی

و غیرقندی شیرگاو با آنزیم کیموتریپسن......... 81

شکل4-2-5- مطالعه خاصیت آنتیاکسیدان کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو

و پپتیدهای حاصل از هضم این پروتئین به وسیلهی آنزیم تریپسین 82

شکل4-2-6- مطالعه خاصیت آنتیاکسیدان کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو

و پپتیدهای حاصل از هضم این پروتئین به وسیلهی آنزیم کیموتریپسین.............................................. 83

شکل 4-2-7- در این شکل معادل ترولوکس (TEAC) کازئین قندی و غیرقندی شیرگاو

و پپتیدهای حاصل از هضم 2 و4 ساعته با آنزیم تریپسین آمده است84

شکل 4-2-8- در این شکل معادل ترولوکس (TEAC) کازئینهای قندی و غیرقندی

شیرگاو و پپتیدهای حاصل از هضم 2 و4 ساعته با آنزیم کیموتریپسین آمده است...................................... 85

شکل4-2-9- نتایج آزمون سنجش آلرژی کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو

و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آنها........... 87

شکل4-2-10- مقایسهی میزان آلرژیزایی کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو

با پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آنها با دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین...................................

جدول اختصارات

نام کامل	نام اختصاری
Angiotensin Converting Enzyme	ACE
2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)	ABTS
8- aniline-1-naphthalenesulfonic acid	ANS
Ammunium persulfate	APS
Bovine serum albumin	BSA
Circular dichroism	CD
Ethylenediaminetetraacetic acid	EDTA
N-3-2-furylacrylolyl-phenylalanylglycylglycin	FAPGG
Intrinsically unstructured protein	IUP
O- phthaladehyde	OPA
Trolox Equivalent Antioxidant Capacity	TEAC

فصل اول

مقدمه

1-1- شیر

شیر یک مایع زیستی پیچیده متشکل از آب، پروتئین، چربی، کربوهیدرات، مواد معدنی و برخی ترکیبات فعال زیستی از جمله آنزیمها و ویتامینها میباشد که به عنوان اولین ماده غذایی برای نوزاد، بوسیله غدد پستانی موجودات پستاندار ساخته میشود. در اوایل دوران شیردهی، شیر آغوز[1] نامیده میشود که سرشار از آنتیبادیهایی است که خطر ابتلای نوزاد به بسیاری از بیماریها را کاهش میدهد. شیر به عنوان اولین مادهی غذایی برای نوزاد شامل اکثر ترکیبات ضروری و مورد نیاز برای رشد و نمو است. در شکل (1-1) ترکیبات اصلی موجود در شیر مشاهده میشود (Pehrsson، 2000).

شکل1-1-نمایی از ترکیبات موجود در شیر.

شیر نه تنها به عنوان یک مادهی غذای برای تغذیهی نوزاد تازه متولد شدهمطرح است بلکه به عنوان یک مادهی غذایی ارزشمند و مغذی برای انسان در تمام کشورهای جهان استفاده می شود. امروزه در سراسر جهان دامداریهای بزرگ در سطح وسیع به تولید شیر و محصولات لبنی مشغولند به طوریکه در سال 2011 میزان تولید شیر در جهان 730 میلیون تن بوده است. هندوستان به عنوان بزرگترین کشور تولید و مصرف کننده شیر در جهان و نیوزلند، 28کشور عضو اتحادیه اروپا، استرالیا و ایالات متحدهی آمریکا به عنوان بزرگترین صادر کننده های شیر و محصولات لبنی میباشند. همچنین چین و روسیه به عنوان بزرگترین واردکنندگان شیر و محصولات لبنی در جهان شناخته میشوند (Blasko، 2011).

1-2- ترکیبات شیر

همانطور که در بالا ذکر شد، شیر یک مادهی غذایی غنی از پروتئین، کربوهیدرات، چربی و ترکیبات معدنی است. درصد، اندازه و نوع هر یک از ترکیبات تشکیل دهنده شیر بسته به گونه جاندار متفاوت است. به عنوان مثال درصد پروتئین شیر انسان نسبت به شیر گاو پایینتراست در صورتی که درصد کربوهیدرات و چربی آن بالاتر میباشد. شیر اسب والاغ کمترین میزان چربی را در بین گونههای مختلف دارد. همچنین شیر انسان فاقد پروتئین بتالاکتوگلوبولین[2] است، درصورتی که این پروتئین یکی از پروتئینهای اصلی آب پنیر است و به مقدار قابل ملاحظهایی در شیرگاو دیده میشود. در جدول (1-1) درصد ترکیبات موجود در شیر برخی جانوران مشاهده میشود(Nelson و همکاران 1951 ، Barlowska و همکاران 2011).

جدول1-1- ترکیبات سازنده شیر جانوران مختلف بر حسب درصد

1-3- پروتئینهای شیر

اکثر پروتئینهای شیر در طول زمان شیردهی بوسیلهی سلولهای پوششی غدد پستانی تولید و ترشح میشود. این سلولها علاوه بر پروتئین، ترکیبات دیگری مانند چربی (تریآسیل گلیسرول[3] و دیگلیسرول[4]) و کربوهیدرات (لاکتوز[5]) را نیز تولید و ترشح میکنند (Bouguyo و همکاران 2006، De Kruif و همکاران 2003).

پروتئینهای شیر از نظر ارزش غذایی و فعالیت زیستی بسیار حائز اهمیت هستند و به دو گروه کازئینها (آلفا S1، آلفا S2، بتا و کاپا کازئین) و پروتئینهای آبپنیر (آلفالاکتالبومین[6]، بتا لاکتوگلوبولین، سرم آلبومین[7] و ایمونوگلوبولین[8]) تقسیم میشوند. کازئینهای شیر گاو 80درصد و پروتئینهای آبپنیر بین20 تا 45درصد کلپروتئینهای شیر انسان را تشکیل
میدهند ( Kunz و همکاران 1990، Wong و همکاران 1996).

شکل1-2- پروتئینهای تشکیل دهنده شیرگاو.

1-3-1- پروتئینهای آبپنیر

پروتئینهای آبپنیر از نوع کروی هستند که حدود 20 درصد پروتئینهای شیر را شامل می شوند. از لحاظ ساختاری این پروتئینها دارای مقدار قابل توجهی مارپیچآلفا[9] در ساختارشان میباشند.

آمینواسیدهای اسیدی، بازی، آبگریز[10] و آبدوست[11] به صورت نسبتا متعادل در طول زنجیره ی پلیپپتیدی این پروتئینها وجود دارد. این پروتئینها در محیط آبی شیر به صورت محلول هستند (Evans، 1982).

پروتئینهای آبپنیر شامل بتالاکتوگلوبولین، آلفالاکتالبومین، ایمونوگلوبولین، آلبومین سرمی، لاکتوفرین[12] و لاکتوپراکسیداز[13] میباشد که غلظت و درصد این پروتئینها در شیر نسبت مستقیم با نوع آبپنیر شامل اسیدی با pH پایین تر از 1/5 و بازی با pH بالاتر یا مساوی 6/5، منبع شیر ( گونهی حیوان)، زمان سال، نوع خوراک حیوان و مرحلهی شیردهی دارد (Pintado 2001).

فعالیتهای زیستی مختلفی به پروتئینهای آبپنیر نسبت داده شده است که از بین این فعالیتها، خواص ضد میکروبی این پروتئینها به میزان زیادی بررسی شده است (Clare وهمکاران 2003).

جدول1-2- برخی ویژگیهای پروتئینهای آبپنیر شیرگاو.

1-3-2- کازئینها

کازئینها فسفو پروتئینهایی غنی از آمینواسیدهای گلوتامین، لوسین، سرین، لیزین و پرولین میباشند که80 درصد پروتئینهای شیرگاو را تشکیل میدهند. کازئینها به چهار گروه اصلی آلفا S1، آلفا S2، بتا و کاپا کازئین تقسیم میشوند. این پروتئینها تحت تاثیر تغییرات پس از ترجمه نظیر فسفوریلاسیون و گلیکوزیلاسیون قرار میگیرند و به صورت امولسیون یا معلق در فاز آبی شیر وجود دارند. این پروتئینها ساختارهای کروی به نام میسل کازئینی تشکیل می دهند (Wong 1996، Dalgleish و همکاران 1998). در جدول زیر برخی ویژگیهای کازئین ها مشاهده میشود.

جدول1-3- برخی از ویژگیهای کازئینهای شیرگاو.

میسل کازئین دارای اندازههای متنوعی از 20 تا300 نانومتراست. تشکیل میسل در شیر رابطهی مستقیم با غلظت کازئین، دما، pH و مقدار یونهای موجود در شیر از جمله کلسیم دارد (Dekruif و همکاران2003، Leclerc و همکاران 1997).

همچنین مطالعات گذشته نشان داده است که یون کلسیم فرایند تشکیل میسل را تسهیل میکند. یون کلسیم از طریق اتصال به گروهای فسفر باقیماندههای آمینواسیدهای سرین فسفوریله در بخشهای آبدوست پروتئین باعث تشکیل پلهای کلسیم- فسفات بین کازئینها میشود که این پدیده به نوبهی خود به فرآیند تشکیل میسل کمک میکند (Rollema و همکاران 1992).

نیروهای اصلی پایدار کنندهی میسل، پیوندهایهیدروژنی، برهمکنشهای آبگریز و الکتروستاتیک، پیوندهای دیسولفید و پلهای نمکی (کلسیم، فسفر، منیزیم وسیترات) می باشد.

شکل1-3- نمایی از چگونگی تشکیل میسل کازئین شیر( Martin، 1999).

در بخشهای داخلی میسل کازئینی اغلب کازئینهای آلفا و بتا و در بخشهای سطحی آن کازئین کاپا دیده میشود. کازئینکاپا یک گلایکوپروتئین با بخش قندی متصل به انتهای C پروتئین است. مطالعات پیشین همچنین نشان داده است که وجود کازئین کاپا و گروههای کربوهیدرات آن در سطح میسل به پایداری و تعلیق میسل در فاز آبی کمک میکند به طوری که حذف انتهای C و گروه های کربوهیدراتی به وسیلهی آنزیمهایی مانند رنین باعث تخریب ساختار میسل میشود (Holt وهمکاران 1996و1992، Mc Mahon و همکاران 1998).

1-3-3- کازئینبتا

کازئینبتا یک فسفو پروتئین با زنجیرهی پلیپپتیدی شامل 209 آمینواسید و وزن مولکولی kDa 24 میباشد. این پروتئین دارای یک انتهایN کوتاه و قطبی و یک انتهای C بلند بدون بار و آبگریز است که به آن خاصیت دوگانهدوست[14] میدهد. کازئینبتا در انتهایN دارای 5 گروه فسفاتی متصل به باقیماندههای آمینواسیدی سرین میباشد که بیشترین بار پروتئین را به خود اختصاص میدهد(Rollema و همکاران 1992). این پروتئین30 تا 36 درصد کازئین های شیرگاو را شامل میشود. ساختار دوگانه دوست کازئینبتا نقش مهمی در فعالیتهای زیستی مختلف آن از جمله فعالیت چاپرونی و تشکیل میسل و ایجاد ویژگیهای امولسیونی شیر دارد (Horne و همکاران 2002).

کازئینبتا شیر گاو به طور طبیعی به دو صورت A1 و A2 دیده میشود. نوع اصلی کازئین بتا A2 است در حالیکهA1 از جهش جایگزینی پرولین 67 با هیستیدین ایجاد شده است(Farrel و همکاران2004، Kaminski و همکاران 2007،Keating و همکاران 2008).

شکل 1-4- جهش جایگزینی پرولین67 وتبدیل آن به هیستیدین در کازئین بتاA1

مطالعات پیشین نشان داده است که بین مصرف کازئین بتاA1 و مرگ و میر ناشی از بیماریهای قلبی- عروقی، سختی شریانهای خون و دیابت نوع یک رابطهی معنیداری وجود دارد. همچنین بررسیها نشان داده که تغذیه با کازئینبتاA1 در مقایسه با نوع A2 با افزایش میزان کلسترول خون و تجمع چربی در عروق خونی ارتباط دارد (Mc Lachlan و همکاران 2001، Tailford و همکاران 2003، Beales و همکاران 2002، Elliot و همکاران 1988).

همانطور که ذکر شد، هضم ناقص کازئین بتا باعث تولید پپتیدی به نام بتا-کازومورفین[15]7 میشود که در انتهای خود دارای توالی پپتیدی پرولین-گلایسین-پرولین-ایزولوسین میباشد. این توالی مشابه توالی پروتئین ناقل گلوکز(GLUT2) در سلولهای بتای پانکراس است. اتصال بتا-کازومرفین7 به GLUT2 در سلولهای پانکراس باعث حملهی آنتیبادی به سلولهای بتای پانکراس و تخریب این سلولها و ایجاد دیابت نوع1 میشود. از طرفی برخی محققان عقیده دارند شباهت ساختار فضایی اپیتوپ[16] کازئینبتا به برخی از سلولهای پانکراس باعث حملهی آنتیبادیها به این سلولها و تخریب آنها و ایجاد دیابت نوع 1 میشود (Woodford، 2008).

پروتئینهای کازئینی به دلیل دارا بودن درصد بالایی از آمینواسیدهای گلوتامین و پرولین (15 درصد) نمیتوانند ساختار دوم پایداری تشکیل دهند. از اینرو این پروتئینها متعلق به خانواده پروتئینی هستند که به اختصارIUP[17] خوانده میشوند و به طور طبیعی فاقد ساختار دوم منظم میباشند(Farrell و همکاران 2006و2002، Holt و همکاران 1988، Tompa و همکاران 2002). مطالعه به کمک دستگاه دورنگنمای دورانی نشان داده است که در ساختار دوم کازئینبتا10درصد مارپیچآلفا و13درصد صفحات بتا وجود دارد. همچنین توالیهای پپتیدی 28 تا 1و 52 تا 31 در محیط آبی ساختار پیچه نامنظم[18] دارند(Rollema وهمکاران1992، Holt وهمکاران 1993).

1-4- فعالیتهای زیستی کازئینها

1-4-1- فعالیت چاپرون کازئینهای شیر

چاپرونها دستهای از مولکولهای پروتئینی هستند که از برهمکنش نامناسب سایر مولکول های پروتئینی جلوگیری میکنند. در نتیجه چاپرون مانع تجمع و رسوب پروتئینها در داخل سلول میشود(Ehrnsperger و همکاران 1997).

مولکولهای چاپرون به تاخوردگی صحیح و طبیعی سایر پروتئینها کمک میکنند. خانواده های پروتئینی متفاوتی با فعالیت چاپرونی شناسایی شدهاند. در سلولهای یوکاریوتی مولکولهای چاپرون اغلب در داخل شبکهی آندوپلاسمی و سیتوزول یافت میشود. در سیتوزول بیشترین میزان سنتز و انتقال پروتئین انجام میشود تا از تاخوردگی صحیح پروتئینها اطمینان حاصل شود(Ellis و همکاران 1996، Ruddon و همکاران 1997). تنشهای فیزیولوژیکی مانند گرما و تنشهای اکسایشی بیان مولکولهای چاپرون را 10 تا 20 برابر افزایش میدهد. همچنین مطالعات گذشته نشان میدهد که هم توالی کد کنندهی پروتئین و هم توالی تنظیمی در ژن مولکولهای چاپرونی به شدت حفاظت شده است(Ingolia و همکاران 1980، Hunt و همکاران 1985، Corces و همکاران 1980، Lindsquist و همکاران 1986).

مطالعات پیشین نشان میدهد که کازئین بتا، کازئین کاپا و بخصوص کازئینهای آلفا S1 و آلفا S2 دارای فعالیت چاپرونی هستند (Humphreys و همکاران 1999). کازئینها در شیر از تجمع و رسوب پروتئینهای آب پنیر در اثر حرارت جلوگیری میکنند(Morr و همکاران 1968، Zhang و همکاران 2005، Barzegar و همکاران 2008). حضور گروههای فسفات نقش مهمی در فعالیت چاپرونی کازئینها دارد. حذف این گروهها از کازئینهای آلفا و بتا باعث کاهش توانایی آنها در جلوگیری از واسرشته شدن، تجمع و رسوب پروتئینهای هدف می شود ( Matsudomi و همکاران 2004، Koudelka و همکاران 2009).

1-4-2- پپتید های فعال زیستی

1-4-2-1- پپتید های فعال زیستی

پپتیدهایی که در محیط آزمایشگاهی یا در بدن موجودات زنده به وسیله آنزیمهای آبکافت کننده از هضم ناقص پروتئینها ایجاد و دارای عملکرد زیستی یا تاثیر فیزیولوژیک خاص باشند را اصطلاحا پپتیدهای فعال زیستی[19] مینامند. این پپتیدها میتوانند از پروتئینهای باکتریایی، گیاهی و یا جانوری بدست آیند.

از جمله عملکردهای زیستی این پروتئینها میتوان به خاصیت کاهندگی فشارخون، خاصیت آنتیاکسیدانی، فعالیت ضد میکروبی، توانایی انتقال مواد معدنی و خاصیت ضد سرطانی آنها اشاره کرد (Bruck و همکاران 2002).

پپتیدهای فعال زیستی زمانی که در ساختار پروتئین قرار دارند ممکن است هیچ نوع فعالیت زیستی از خود نشان ندهند اما پس از آبکافت پروتئین بوسیله پروتئازها و آزاد شدن قطعات پپتیدی خواص زیستی آنها آشکار میشود (Korhonen و همکاران2006).

1-4-2-2- منابع اصلی پپتیدهای فعال زیستی

از منابع غنی پپتیدهای فعال زیستی میتوان به تخم مرغ، شیر و به میزان کمتر گوشت برخی از حیوانات مانند ماهی و برخی از پروتئینهای گیاهی مانند سویا اشاره کرد (Korhonen و همکاران 2003، Eedmann وهمکاران 2008).

1-4-2-3- برخی از خواص پپتیدهای فعال زیستی

1-4-2-3-1- خاصیت ضد فشار خون

فشار خون بالا یک عامل خطرناک برای بیماریهای قلبی-عروقی از جمله بیماری عروق کرونر قلب و سکتههای مغزی محسوب می شود. در بدن انسان سیستمی با نام سیستم رنین- آنژیوتنسین تنظیم فشار خون را بر عهده دارد.

آنژیوتنسین-I پروتئینی است که از پیشسازی با نام آنژیوتنسینوژن[20] در کبد ساخته و به خون رها میشود. در خون آنزیم رنین[21] این پیش ساز را به آنژیوتنسین-I تبدیل میکند. آنژیوتنسین-I وارد شش شده و در آنجا بوسیله آنزیم ACE[22] به آنژیوتنسین-II یعنی شکل فعالتر آن تبدیل میشود. آنزیمهای آنژیوتنسین-I وII قطر عروق خونی را کاهش میدهند و بدین ترتیب فشار خون را بالا میبرند. بنابراین هر ترکیبی که بتواند از فعالیت این سیستم یا آنزیم ACE جلوگیری کند به درمان فشار خون کمک مینماید (Laplaize و همکاران 2003،Jingbo و همکاران 2010، Guan-Hong و همکاران 2005).

شکل1-5- نمایی از سیستم رنین- آنژیوتنسین به عنوان سیستم مهم تنظیم کننده فشار خون.

مطالعات پیشین نشان میدهد برخی از پپتیدهای حاصل از آبکافت آنزیمی پروتئینهای شیر از جمله کازئینها و پروتئینهای آب پنیردارای خاصیت مهار آنزیم ACE میباشند.

به عنوان مثال پپتیدهای مشتق شده از کازئینهای شیر گاو با نام کازوکینین[23] که شامل توالیهای 21 تا 23، 23 تا 34 و 194تا 199 ازکازئین آلفا S1، توالی 177 تا 183 کازئینبتا دارای خاصیت مهار آنزیم ACE است (Maruyama وهمکاران 1982-1985).

برخی از پپتیدهای حاصل از پروتئینهای آب پنیر نیز مهار کنندهی آنزیم ACE میباشند. به عنوان مثال توالی پپتیدی 142 تا 148 بتا لاکتوگلوبولین مهار کنندهی قوی آنزیم ACE در محیط آزمایشگاهی میباشد (Laplaize و همکاران 2003).

مطالعات زیادی بر روی رابطهی بین ساختار و فعالیت مهار آنزیم ACE پپتیدهای مهار کنندهی این آنزیم انجام شده است. این مطالعات نشان میدهد که انتهای C این پپتیدها نقش مهمی در اتصال آنها به آنزیم ACE دارد.

همچنین این بررسیها نشان میدهد که پپتیدهای که در انتهای C خود دارای آمینواسیدهای آبگریز مانند تریپتوفان، تیروزین، فنیلآلانین و پرولین هستند توانایی بالایی در مهار آنزیم ACE از خود نشان میدهند (Cheung و همکاران 1984).

1-4-2-3-2- فعالیت آنتی اکسیدانی

مطالعات پیشین نشان میدهد بسیاری از بیماریها ازجمله آلزایمر، دیابت، سختی شریانهای خون، ورم مفاصل و سرطان رابطهی معنی داری با میزان استرسهای اکسایشی، حضور رادیکال های آزاد[24] و گونههای فعال اکسیژنی[25] دارد. این ترکیبات که میتواند از محیط خارج وارد بدن فرد شود و یا نتیجهی فرآیندهای متابولیکی داخل سلول باشد با آسیب رساندن به بخشهای مختلف سلول مانند چربیهای موجود در غشای سلول، پروتئینها و DNA سلول باعث اختلال در عملکرد آن میشود و میتواند سلول را به سمت مرگ برنامهریزی شده سلولی[26] و یا سرطانی[27] شدن ببرد.

امروزه در بسیاری از صنایع از جمله در صنایع غذایی، صنایع آرایشی و دارویی از ترکیبات آنتیاکسیدان مصنوعی برای جلوگیری از اکسایش مواد سازنده استفاده میشود که خود این ترکیبات مصنوعی عوارض جانبی مختلفی را ایجاد میکنند. بنابراین جایگزینی این ترکیبات با آنتیاکسیدانهای طبیعی بسیار حائز اهمیت است (Abuja و همکاران 2001، Liu و همکاران 2003، Okada و همکاران 1998، Collins و همکاران 2005).

بررسیها نشان میدهد که پپتیدهای مشتق شده از کازئین آلفا دارای توانایی مهار رادیکال های آزاد و جلوگیری از پراکسیداسیون آنزیمی و غیرآنزیمی لیپیدها میباشند(Rival و همکاران 2001).

1-5- مشکلات ناشی از مصرف شیر در افراد

1-5-1- عدم تحمل لاکتوز

عدم تحمل لاکتوز نتیجهی ناتوانی در هضم قند شیر اغلب به علت کمبود یا نبود آنزیم لاکتاز[28] رودهای میباشد که با علائمی همچون نفخ، دردهای شکمی، اسهال و استفراغ همراه است.

آنزیم لاکتاز رودهای قند دیساکارید شیر را به دو قند ساده گلوکز و گالاکتوز تبدیل میکند که این مونوساکاریدها بوسیله سلولهای روده قابل جذب هستند(Cuatrecasas و همکاران 1965، Huang و همکاران 1968).

کمبود آنزیم لاکتاز اغلب به دو صورت در افراد بروز میکند:

1- آنزیم یا به صورت جزئی و یا به طور مطلق در افراد تولید نمیشود و کمبود آنزیم لاکتاز به صورت مادر زادی بسیار نادر است.

2- در مواردی نیزآسیب به مخاط رودهی کوچک باعث کاهش میزان این آنزیم و در نتیجه اشکال در هضم لاکتوز شیر میشود.

توصیههای درمانی که برای افراد مبتلا به عدم تحمل لاکتوز وجود دارد، معمولا استفاده نکردن از فراوردههای لبنی یا کاهش مصرف این فراوردهها است. همچنین استفاده از فرآورده های لبنی که لاکتوز آنها بطور کامل حذف شده است راه حلی است که به وسیلهی زیست- فناوری[29] ارائه شده است. همچنین افزودن آنزیم لاکتاز به شیر میتواند با شکستن لاکتوز به گلوکز و گالاکتوز از ایجاد عوارض ناشی از عدم هضم لاکتوز در افرادی که قادر به هضم این دی ساکارید نیستند جلوگیری کند.

1-5-2- آلرژی به پروتئین های شیر

بین2 تا 7درصد کودکان به شیر گاو آلرژی[30] نشان میدهند که 60 تا70درصد آنها در سال دوم زندگی و 84 تا 87 درصد آنها در سال سوم بهبود مییابند. در آلرژی به شیر گاو سیستم ایمنی دخالت دارد و از اینرو با عارضهی عدم تحمل لاکتوز متفاوت است (Caffarelli و همکاران 2010).

آنتیژن[31] مولکولی است که اغلب سیستم ایمنی را وادار به پاسخ گویی اختصاصی با استفاده از آنتیبادی میکند. بخشی از مولکول آنتیژن که بوسیله مولکول آنتیبادی شناسایی و به آن متصل میشود اصطلاحا اپیتوپ[32] نام دارد که در مورد پروتئینها میتواند به دو صورت اپی توپ خطی[33] (توالی آمینو اسیدی) و اپیتوپ ساختار فضایی[34] (ساختار سوم پروتئین ) باشد

شکل1-6- نمایی از انواع اپیتوپهای خطی و فضایی پروتئینی.

پاسخ سیستم ایمنی به پروتئینهای شیر به عنوان آنتیژن بر اساس میزان حساسیت فرد میتواند از انواع بسیار خفیف تا شوک آنافیلاکسی و مرگ متفاوت باشد. معمولا آلرژی به شیر گاو سه دستگاه گوارش، تنفس و پوست را درگیر میکند (Baehler و همکاران 1996، Salvatore و همکاران 2002، Host و همکاران1994، Heine و همکاران2002).

شکل1-7- علائم حساسیت به شیرگاو.

به علت طیف وسیع علائم تشخیص، آلرژی به شیر در کودکان یکی از چالشهای پزشکی محسوب میشود. در صورتی که آلرژی کودک به شیر ثابت شود کودک و مادر هر دو از مصرف شیر و فراورده های لبنی منع میشوند که این خود میتواند باعث کمبود انواع ویتامین و مواد معدنی در زمان رشد کودک شود و او را به انواع بیماریها از جمله راشیتیسم مستعد میکند.

یکی از روشهایی که به وسیله آن میتوان میزان حساسیت[35] به شیر را در نوزادان کاهش داد، آبکافت[36] ناقص پروتئینهای شیر میباشد. امروزه انواع مختلفی از این نوع شیرها در بازار برای مصرف وجود دارد. البته این روش نیز به طور کامل موثر نیست و بهترین راه برای جلوگیری از خطرات ناشی از مصرف شیر در کودکان عدم مصرف شیر توسط مادر و کودک محسوب می شود (Jarvinen و همکاران 1999، Terheggen-Lagro و همکاران 2002، Sampson و همکاران1991).

1-5-2-1- معرفی انواع آزمونهای رایج جهت مطالعهی فرآیند آلرژی

برای تشخیص آلرژی یا آزمونهای پوستی و یا از خون فرد بیمار استفاده میشود (Garcia-Ara و همکاران 2001، Canani و همکاران 2007). در آزمون پوستی قسمتی از پوست بیمار پس از خراش پوستی با یک وسیلهی نوک تیز مقداری از آنتیژن با آن ناحیه تماس داده می شود و از روی قطر ناحیه التهاب و اندازه تاول میزان حساسیت فرد سنجیده میشود (Yuen و همکاران 2007).

شکل1-8- آزمون خراش پوستی برای تعیین میزان حساسیت فرد به مادهی آلرژی زا.

در آزمونهای خونی که بسیار اختصاصی تر از آزمون پوستی است نمونه سرم خون بیمار که دارای آنتیبادی علیه آلرژن خاص میباشد استفاده میشود. معمولا از روش الایزا[37] برای انجام آزمونهای خون استفاده میشود که میتواند به صورت رنگسنجی یا اندازهگیری نشر فلورسانس[38] و لومینسانس[39] انجام شود.

1-5-2-2- آزمون الایزا

از این روش میتوان برای تشخیص یک آنتیبادی اختصاصی که بر علیه یک آلرژن خاص ترشح شده استفاده کرد. آزمون الایزا به روشهای مستقیم[40]، غیرمستقیم[41]، ساندویچی[42] و رقابتی[43] انجام میگیرد که در زیر روش غیرمستقیم که در این پژوهش استفاده شد، شرح داده شده است.

در روش الایزای غیرمستقیم، مادهی آلرژن به چاهکهای پلیت 96 خانه ایی الایزا اضافه میشود. سپس پلیت در یک مدت زمان خاص (معمولا به صورت یک شبانه روز در 4 درجهی سانتیگراد) انکوبه میشود. پس از پایان مدت زمان انکوبه پلیت را با بافر شستشو (بافر فسفات سالین حاوی تووین)، 3 مرتبه شستشو میدهند تا آلرژنهایی که به آنتیبادی متصل نشده از چاهک خارج شود. در مرحلهی بعد سرم بیمار به چاهکها افزوده میشود و پلیت مجددا به صورت یک شبانه روز در دمای 4 درجهی سانتیگراد انکوبه میگردد. پس از پایان مدت زمان انکوبه و شستشوی پلیت، آنتیبادی ثانویه که به یک آنزیم (معمولا پراکسیداز یا آلکالین فسفاتاز) متصل است به چاهکها اضافه شده و پلیت به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجهی سانتیگراد در بن ماری انکوبه میگردد. در مرحلهی بعد، سوبسترای آنزیم به چاهکها اضافه و پلیت به مدت 15 دقیقه در دمای 37 درجهی سانتیگراد انکوبه میشود. در نهایت محلول متوقف کنندهی واکنش به چاهکها اضافه شده و میزان جذب یا نشر در یک طولموج خاص خوانده میشود.

1-6- قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها

قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها اولین بار در سال 1912 به وسیلهی میلارد شرح داده شد. در این واکنش گروه کربونیل قند احیا کننده با گروههای آمین آزاد آمینواسیدهای پروتئین از جمله اپسیلون آمینواسید لیزین، آمینواسیدهای آرژنین و هیستیدن و آمین آلفای انتهای N پروتئین واکنش میدهد.

واکنش میلارد طی 3 مرحله انجام میشود:

مرحلهی اول: حملهی نوکلئوفیلی گروه آمین آزاد پروتئین به گروه کربونیل قند و تولید حدواسطهای ناپایداری به نام بازشیف است که طی یک مرحله نوآرایی ساختاری، گلوسیتول و کتوآمین (محصول آمادوری) را تولید میکنند.

مرحلهی دوم: شامل تبدیل محصولات آمادوری از طریق واکنشهای اکسایش-کاهش به ترکیبات کربونیلی بسیار واکنش پذیر میباشد.

مرحلهی سوم: واکنش ترکیبات کربونیلی با زنجیرههای جانبی نوکلئوفیلی آمینواسیدهای همان پروتئین یا پروتئینهای مجاور و ایجاد ترکیبات بسیار سمی پایدار به نام محصولات پیشرفتهی واکنش میلارد[44] (AGE) است (Lapolla و همکاران 2005، Miura و همکاران 2003).

حضور ترکیبات احیاکننده در محیط میتواند سرعت تولید ترکیبات حدواسط بازشیف را افزایش داده و به طور انتخابی مسیر واکنش را به سمت تولید گلوسیتول پیش ببرد و محصولات کتوآمین (آمادوری) کمتری نسبت به شرایط غیراحیایی تولید شود (Watkins و همکاران 1985).

مطالعات پیشین نشان میدهد قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها با تغییرات ساختاری و عملکردی پروتئین همراه است. از آنجایی که بسیاری از این تغییرات با بیماریهای مختلف از جمله آلزایمر، پارکینسون، سرطان و بیماریهای قلبی-عروقی در ارتباط هستند و همچنین تغییرات ساختاری پروتئینهای مواد غذایی باعث تغییر رنگ، طعم، بو و مزهی این مواد میشود، بررسی فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی از اهمیت زیادی برخوردار است. مطالعات فراوانی روی فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینهای مختلف از جمله پروتئینهای شیر انجام شده است.

شیر به عنوان یک مادهی غذایی غنی از پروتئین، کربوهیدرات و ترکیبات احیا کنندهایی مانند ویتامینهای E و C محیط مناسبی را برای قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها در شرایط احیایی فراهم میکند. مطالعات پیشین نشان میدهد فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی پروتئین های شیر بر روی خواص مختلف این پروتئینها از جمله خواص فیزیکی، شیمیایی، بیوشیمیایی و عملکردهای زیستی آنها تاثر قابل توجهی دارد. به عنوان مثال Lee در سال 1979نشان داد قندی شدن غیرآنزیمی کازئینهای شیرگاو با کاهش ارزش تغذیهایی و قابلیت هضم این پروتئینها همراه است. همچنین Sun در سال 2005 نشان داد قندی شدن غیرآنزیمی آلفا-لاکتالبومین شیرگاو باعث افزایش توان مهار رادیکالهای آزاد و خاصیت آنتیاکسیدانی این پروتئین میشود.

[1]Colostrum

[2] Beta-lactoglobulin

[3]Triacylglycerol

[4]Diacylglycerol

[5]Lactose

[6]α-Lactalbumin

[7]Serum Albumin

[8]Immunoglobulins

[9]Alpha- helix

[10]Hydrophobic

[11]Hydrophilic

[12]Lactoferrin

[13]Lactoperoxidas

[14]Amphiphilic

[15]Beta-casomorphin7

[16]Epitope

[17]IUP: Intrinsically unstructured proteins

[18]Randum co

[19]Bioactive peptides

[20]Angiotensinogen

[21]Renin

[22]Angiotensin Converting Enzyme

[23] Kasokinin

[24]Free radicals

[25]Reactive oxygen

[26]Apoptosis

[27]Cancer

[28]Lactase

[29]Biotechnology

[30]Allergy

[31]Antigen

[32]Epitope

[33]Sequential epitope

[34]Conformational epitope

[35]Reflex

[36]Hydrolyses

[37]ELIZA: Enzyme-linked immunosorbent assay

[38]Fluorescence

[39]Luminescence

[40]Direct ELISA

[41]Indirect ELISA

[42]Sandwich ELISA

[43]Competitive ELISA

[44] Advanced glycation end products (AGEs)

دریافت فایل

مطالعه ی ساختار، فعالیت چاپرونی و آلرژی زایی کازئین بتای قندی و غیرقندی...

یاهو مارکت دوشنبه 20 آذر 1396 ساعت 17:57

0 نظر

دانلود حل تمرین شیمی معدنی شرایور ویرایش ششم

حل المسائل شیمی معدنی شرایور

نویسنده: Alen Hadzovic
تاریخ انتشار: ۲۰۱۴
ویرایش: ششم
فرمت: PDF
تعداد صفحات: ۳۰۰

دریافت فایل

بیان مسأله

از آنجایی که دیکته یکی از مهمترین مواد درسی دانش آموزان محسوب می شود. که آن نیز به علت مهم بودن مهارت های نوشتاری است، شاید بتوان دلیل این امر را در عینی بودن مهارتهای نوشتاری دانست که امکان تحلیل مشکلات کودک را فراهم می سازد. با توجه به اهمیت موضوع سعی کردم دقت و تعمق بیشتری در درس املاء دانش آموزان داشته باشم. بنابراین مشکل این دانش آموز فکرم را خیلی مشغول کرده است. از آنجایی که وظیفه شغلیم ایجاب می کرد سعی کردم برای حل این مشکل راه حلهایی پیدا کنم تا شاید بتوان با به کار گرفتن این شیوه ها به کودکانی که به علت ضعف در دیکته به آنها برچسب کم ذهنی ، تنبلی ، حواس پرتی ، عقب مانده زده می شود کمک کرد. املاء کلمه ای عربی و دارای معانی گوناگون از قبیل :پر کردن ،بر سر جمع سخن گفتن و تقریر است . دیکته کلمه ای است فرانسوی به معنای مطلبی که کسی املاء کند و دیگری بنویسد. واژه ی دیکتاتورهم فرانسوی از همین کلمه است و به معنا ی فرما نروایی است که با قدرت و زور حکومت افکار و عقاید خود را بر جامعه تحمیل کند .منظور از اضطراب هیجان نا خوشایندی است که با اصطلا حاتی مانند «نگرانی »،« دلشوره»،« وحشت»و«ترس» بیان می شود . اضطراب سبب به هم ریختن تعادل موجود می گرددو چون فرد دائما به منظور برقراری تعادل کوشش می کند ، می توان گفت اضطرب یک محرک بسیار قوی است که امکان دارد گاهی مفید و زمانی مضر باشد و این بستگی به درجه «ترس» ومقدار «خطری » دارد که متوجه فرد است اضطراب تنها زمانی نا بهنجار محسوب می شود که در برابر موقعیتهایی رخ دهد که اکثر مردم به راحتی آنها را حل و فصل می کنند.

توصیف وضعیت موجود:

اینجانب ............ مدت .............. سال است که در آموزش و پرورش در حال تدریس می باشم و هم اکنون نیز در آموزشگاه ..................شهرستان ...... مشغول تدریس در پایه .... هستم. خوب نوشتن و صحیح نوشتن یک توانایی ایست که ما به عنوان معلمان شکوفا کردن این توانایی ها را عهده دار هستیم.در ماه مهر وقتی درس را تدریس می کردم و با دانش آموزان در کلاس املا کار می کردم تمام سعی من بر این بود تا دانش آموزانم مشکلی در نوشتن نداشته باشند. زیرا هر معلّمی آرزو دارد که دانش آموزانش درس های او را بهتر و آسان تر یاد بگیرند و گفته هایش در اعماق وجود دانش آموزان نفوذ کند.در این بین تعداد یا زدانش آموزان در صدا کشی کلمات ئ نوشتن املا سطح با دانش آموزان دیگر نبودند با تشویق وراهنمایی به درس های کلاس توجّه نمی کردند . اضطرا ب فراوانی در نوشتن املا داشتند .برای انجام فعالیت های نوشتنی از خود علاقه ای نشان نمی داد ندو زود خسته می شدند. درکلاس آرام و قرار نداشتند بنابراین باخود اندیشیدم چگونه می توانم آنها به درس املاء علاقه مند سازم و مهارت املا را در آنها تقویت کنم؟...

فهرست منابع:

1- بنی اسدی ، حسین (1384) ، آشنایی با طرح ارزشیابی توصیفی ؛ تهران : آزمون نوین.

2- تبریزی ، مصطفی (1384) ، درمان اختلالات دیکته نویسی ؛ تهران : انتشارات فراروان ، چاپ دهم.

3- تبریزی ، مصطفی (1380) ، درمان اختلالات ریاضی ؛ تهران : انتشارات فراروان ، چاپ پنجم.

4- حاجی اسحاق ، سهیلا ، (1382) ، آموزش راههای یادگیری (الگوی یادسپاری) ؛ همدان : انتشارات میهن نو.

5-حبیب الله پور ، منیژه و محمدی رودباری ، فرشته (1381) ، برگزیده های پژوهشی در عمل ، کارشناسی تحقیقات سازمان آ. پ مازندران ، چاپخانه نیما.

6- کرک ، ساموئل ، چالفانت ، جمیز (1377) ، ناتوانیهای یادگیری تحولی و تحصیلی ، (ترجمه: رونقی ، سیمین و همکاران) ، انتشارات آموزش و پرورش استثنایی ، چاپ اول.

7- مردادی، رضا ... [و دیگران] ( 1387)، فرهنگ واژه ها و اصطلاحات در تعلیم و تربیت؛ اصفهان: نشر آموخته، چاپ اول.

اقدام پژوهی معلم پایه چهارم ابتدایی چگونه توانستم ضعف املا دربعضی از دانش آموزانم رابرطرف کنم؟در قالب ورد و قابل ویرایش در 28صفحه بهترین نمونه در فضای مجازی در این قسمت خرید و دانلود کنید.

دریافت فایل

اقدام پژوهی معلم پایه چهارم ابتدایی چگونه توانستم ضعف املا دربعضی از دانش آموزانم رابرطرف کنم؟

یاهو مارکت دوشنبه 20 آذر 1396 ساعت 17:57

0 نظر